联合靶向HIF-1α与GSK-3β通过调控内皮-间质转化逆转肺纤维化的机制研究

《iScience》：Combined HIF-1α blockade and CHIR99021 treatment reverses pulmonary fibrosis via modulation endothelial-to-mesenchymal transition

　　本研究针对放射性肺纤维化（RIPF）及特发性肺纤维化（IPF）缺乏有效逆转策略的难题，探讨了HIF-1α抑制剂2-甲氧基雌二醇（2-ME）与GSK-3β抑制剂CHIR99021联合治疗的协同抗纤维化机制。结果表明，双靶向抑制可显著抑制EndMT、促进DNA损伤修复并诱导染色质重塑（如降低H3K9me3、增加H3K9ac/H3K27ac），从而逆转纤维化进程。该研究为肺纤维化的表观遗传重编程治疗提供了新思路。

　　

肺纤维化，尤其是放射性肺纤维化（RIPF）和特发性肺纤维化（IPF），是严重影响患者生活质量和生存期的难治性疾病。目前临床常用的抗纤维化药物如吡非尼酮和尼达尼布，虽能延缓疾病进展，但难以逆转已形成的纤维化病变，且长期使用可能伴随不良反应。因此，探索能够真正逆转纤维化进程的新策略成为该领域的研究热点。在肺纤维化的发生发展中，内皮-间质转化（EndMT）被认为是关键环节之一。辐射或损伤等因素可诱导肺血管内皮细胞失去其特异性标志物（如CD31），获得间质细胞标志物（如α-SMA），转变为成纤维样细胞，进而分泌大量细胞外基质，导致组织纤维化。这一过程通常伴随着持续的DNA损伤和表观遗传状态的改变，共同推动疾病的恶性进展。

韩国放射医学研究所的Yoon-Jin Lee团队长期致力于肺纤维化机制与治疗研究。他们此前发现，缺氧诱导因子HIF-1α在辐射诱导的EndMT（RI-EndMT）中扮演了核心角色，而其抑制剂2-甲氧基雌二醇（2-ME）能够在一定程度上缓解肺纤维化。与此同时，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的抑制剂CHIR99021，因其在细胞重编程和纤维化消退中的潜在作用而受到关注。那么，将靶向DNA损伤修复的2-ME与可能调控细胞命运的CHIR99021联合使用，是否能产生“1+1>2”的协同效应，从而更有效地逆转肺纤维化？为了回答这个问题，研究人员开展了一系列深入的体外和体内实验，相关成果发表在《iScience》杂志上。

本研究主要运用了细胞生物学（如人脐静脉内皮细胞HUVECs、人肺成纤维细胞HPFs、IPF患者原代细胞培养）、分子生物学（免疫荧光染色、Western Blot、RT-qPCR）、小鼠疾病模型（放射性肺纤维化模型）、谱系追踪技术（Col1a2-CreERT₂;tdTomato报告基因小鼠）、条件性基因敲除（Col1a2-HIF1α KO小鼠）以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）等关键技术方法。

联合应用2-甲氧基雌二醇和CHIR99021可逆转辐射诱导的细胞纤维化改变

研究人员首先在细胞水平验证联合用药的效果。发现单独使用CHIR99021能将经辐射处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的成纤维细胞样形态逆转回正常状态，但无法有效清除辐射引起的持续性DNA损伤焦点（以γH2AX标记）。而2-ME预处理则能显著减少这种持续性DNA损伤。当两者联合使用时，不仅能够更有效地清除DNA损伤焦点，还能显著逆转由辐射引起的细胞骨架重排（Phalloidin染色显示），并增强细胞的成管能力。此外，联合治疗还诱导了多能性相关标志物OCT4、SOX2和Nanog的表达升高，提示细胞可能发生了向更原始状态的重编程。在人肺成纤维细胞（HPFs）中也观察到了类似的反转纤维化表型和清除DNA损伤的效果。

2-ME和CHIR99021的联合疗法通过调控内皮-间质转化和染色质重塑减轻放射性肺纤维化

在动物模型中，联合用药显著改善了小鼠的肺纤维化程度（Ashcroft评分降低）、减少了胶原沉积，并更好地保留了肺泡结构。免疫荧光分析显示，联合治疗能更有效地抑制CD31⁺αSMA⁺的细胞群体（即发生EndMT的细胞），并降低了组织中的缺氧标志物CA9的表达。更重要的是，表观遗传学分析发现，纤维化肺组织中显著升高的抑制性组蛋白标记H3K9三甲基化（H3K9me₃）在联合治疗组被显著抑制，而激活性的组蛋白标记H3K27乙酰化（H3K27ac）和H3K9乙酰化（H3K9ac）则显著增加，表明联合治疗诱导了染色质从抑制状态向开放状态的转变，这有利于促进修复相关基因的表达。

谱系追踪揭示联合治疗抑制成纤维细胞活化并增强内皮修复

为了在体追踪胶原蛋白产生细胞的命运，研究人员使用了Col1a2-CreERT₂;tdTomato报告基因小鼠。实验证实，辐射确实诱导了表达tdTomato的胶原生成细胞大量增加，而联合治疗能显著减少这群细胞的数量。同时，联合治疗组显示了更好的血管结构保存（CD31⁺区域增加），并且CD31⁺tdTomato⁺αSMA^-的细胞群体（即内皮特性得以保留的细胞）比例上升，而CD31⁺tdTomato⁺αSMA⁺的细胞（内皮来源的肌成纤维样细胞）则减少，强有力地证明了联合治疗有效抑制了EndMT进程。

HIF-1α缺失联合CHIR99021治疗可逆转辐射诱导的纤维血管重塑和纤维化

为了明确2-ME的作用靶点HIF-1α在其中的具体贡献，研究者构建了在胶原蛋白阳性细胞中特异性敲除Hif1a基因的小鼠（Col1a2-HIF1α KO）。结果显示，在敲除小鼠中，辐射诱导的纤维化程度、胶原沉积以及tdTomato⁺细胞数量均显著低于野生型小鼠。当在敲除小鼠中再给予CHIR99021时，抗纤维化效果得到进一步增强，表现为tdTomato⁺αSMA⁺和CD31⁺αSMA⁺细胞进一步减少，而保留内皮特征的CD31⁺tdTomato⁺αSMA^-细胞增多。单细胞RNA测序分析进一步证实，在Col1a2-HIF1α KO联合CHIR99021处理的辐射小鼠中，tdTomato⁺细胞更多地表达内皮细胞相关基因（如Kdr, Tie1），而间质相关基因表达减少，表明细胞身份发生了向内皮方向的逆转。

HIF-1α缺失和CHIR99021对Smad信号、组蛋白修饰和Oct4表达的协同作用

机制探讨发现，联合治疗能协同抑制促纤维化的TGF-β/Smad信号通路（p-Smad3水平降低），并协同调控组蛋白修饰（H3K9me₃进一步降低，H3K9ac/H3K27ac增加）。同时，tdTomato⁺OCT4⁺细胞群体在联合治疗组显著富集，这提示表观遗传重编程和细胞可塑性的增强可能是其逆转纤维化的重要机制。

2-ME和CHIR99021的联合治疗可减轻特发性肺纤维化原代细胞的纤维化进展和持续性DNA损伤

最后，研究将视野扩展到临床相关样本。在来自IPF患者的原代成纤维细胞中，联合治疗同样显示出强大的抗纤维化效果：降低了细胞的纤维化形态（Phalloidin强度减弱）、减少了持续性DNA损伤（γH2AX焦点减少）、抑制了胶原蛋白I的表达和细胞收缩能力，并下调了纤维化标志物（波形蛋白、S100A4）的基因表达，同时抑制了细胞增殖（Edu⁺细胞减少）。这表明该联合策略不仅适用于放射性肺纤维化，对特发性肺纤维化也具有潜在的治疗价值。

总结与展望

本研究系统性地阐明了联合靶向HIF-1α和GSK-3β在逆转肺纤维化中的协同作用机制。该疗法通过三管齐下的方式发挥作用：抑制病理性EndMT、促进持续性DNA损伤的修复、以及诱导有利于基因表达和细胞重编程的染色质开放状态。谱系追踪和基因敲除实验证实了HIF-1α在驱动纤维化中的核心地位，并揭示了CHIR99021在促进内皮身份恢复方面的附加价值。尤为重要的是，该策略在IPF患者来源的细胞中同样有效，大大增强了其临床转化潜力。这项研究不仅为理解肺纤维化的逆转机制提供了新的理论框架，更重要的是，为开发能够真正逆转纤维化进程的“重编程”疗法提供了充满希望的新途径。当然，该联合疗法中各事件之间的具体分子联系、潜在的长期安全性等问题，仍需未来更深入的研究来阐明。