MRPL37通过调控线粒体能量代谢促进肝细胞癌进展的机制研究

《iScience》：MRPL37 promotes hepatocellular carcinoma progression through modulating mitochondrial energy metabolism

　　本研究针对肝细胞癌(HCC)能量代谢异常的关键科学问题，通过构建MRPL家族基因的预后模型，首次系统揭示MRPL37通过调控线粒体蛋白质合成和氧化磷酸化(OXPHOS)通路促进HCC进展的新机制。研究人员综合运用生物信息学分析、体外细胞实验和体内动物模型，证实MRPL37高表达与患者不良预后显著相关，其敲低可抑制肿瘤增殖并诱导细胞凋亡。该研究为肝细胞癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点，对推动肿瘤代谢研究领域发展具有重要意义。

　　

肝细胞癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，尤其在中国，其发病形势更为严峻。据统计，肝细胞癌是中国第四大常见癌症和第二大癌症相关死亡原因，每年新增病例超过38万，死亡病例超过33万。尽管近年来手术、肝移植、靶向治疗和免疫治疗等临床治疗手段取得了长足进步，但由于早期诊断困难、治疗耐药性以及疾病复杂的生物学特性，总体治疗效果仍不理想，患者生存率仅约20%。因此，探索肝细胞癌发生发展的新分子机制，为开发新型靶向治疗策略提供理论依据，成为当前肝癌研究领域的迫切需求。

能量代谢重编程是肿瘤细胞的重要特征之一，改变的代谢通路支持肿瘤的快速生长和存活。线粒体作为能量代谢的核心细胞器，在这一过程中发挥着关键作用，特别是通过氧化磷酸化(OXPHOS)过程。线粒体功能障碍已被认为是包括肝细胞癌在内的多种癌症的关键驱动因素。例如，线粒体功能障碍可导致活性氧(ROS)产生，引起DNA损伤和基因组不稳定性，从而加速癌症进展。研究肝细胞癌中线粒体代谢异常，为了解肿瘤发生机制和发现潜在治疗靶点提供了重要视角。

线粒体大亚基核糖体蛋白(MRPLs)是线粒体核糖体的重要组成部分，参与线粒体蛋白质合成过程。近期研究表明，MRPL家族成员与多种癌症的发生发展密切相关。然而，MRPLs在肝细胞癌中的作用仍知之甚少，其潜在机制尚未完全阐明。

在这项发表于《iScience》的研究中，张一干、陈敏杰等研究人员开展了一项系统性的探索工作。他们利用癌症基因组图谱(TCGA)肝细胞癌数据，开发了基于MRPL家族基因的亚型分类和预后模型，并从中鉴定出MRPL37作为与肝细胞癌进展相关的关键基因。

研究团队采用的主要技术方法包括：基于TCGA数据库的生物信息学分析、共识聚类算法、LASSO回归模型构建；细胞功能实验（CCK-8增殖检测、克隆形成、细胞周期与凋亡分析）；体内动物模型（异种移植瘤模型和AKT/NRAS致癌基因驱动的自发肝癌模型）；多组学分析（转录组测序、蛋白质组学、靶向代谢组学）；以及线粒体功能评估（Seahorse能量代谢分析、JC-1膜电位检测）。

构建基于MRPL家族基因的亚型分类模型

研究人员分析了TCGA数据库中371例肝细胞癌样本的RNA测序数据和临床信息，通过一致性聚类分析将样本分为高风险组(n=185)和低风险组(n=186)。主成分分析(PCA)显示两组间基因表达模式存在明显区别。共识累积分布函数(CDF)和delta面积分析确定了最佳聚类数量为2。聚类热图进一步证实了两组之间MRPL家族基因表达的差异。生存分析表明，高风险组的总生存期显著差于低风险组。基因表达分析显示，高风险组中44个基因显著上调，仅2个基因表达无显著差异。

差异基因表达分析发现，高风险组和低风险组之间有66个基因上调，90个基因下调。基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析表明，上调基因主要富集在促进肿瘤增殖的通路中，如细胞分裂、细胞周期和核糖体活性，而下调基因主要参与代谢通路，如脂肪酸代谢、糖酵解/糖异生。此外，高风险组具有显著更高的肿瘤干性评分和免疫检查点基因(如CTLA4和PDCD1)表达水平，表明其具有更强的恶性表型和免疫逃逸能力。

构建基于MRPL家族基因的预后模型

通过最小绝对收缩和选择算子(LASSO)回归分析，研究人员构建了包含10个候选基因的风险评分模型。风险评分计算公式为：风险评分=(0.1797MRPL1)+(0.3634MRPL3)+(0.127MRPL9)+(0.0444MRPL10)+(0.1926MRPL36)+(0.3008MRPL37)+(0.1704MRPL38)+(-0.7307MRPL46)+(0.0688MRPL52)+(-0.2239MRPL54)。随着风险评分增加，肝细胞癌患者的总生存期逐渐降低。该模型预测1年、3年和5年生存率的曲线下面积(AUC)值分别为0.802、0.743和0.735，显示出良好的长期生存预测性能。决策曲线分析(DCA)显示，基于MRPL家族的DCA模型在临床预后预测方面优于其他传统肿瘤生物标志物模型(AFP、MKI67和KRT19)。单变量和多变量Cox分析显示，MRPL37具有最高的风险比(HR)，其mRNA水平在肝细胞癌组织中也显著上调。

MRPL37上调与肝细胞癌进展和不良预后相关

对TCGA和国际癌症基因组联盟(ICGC)数据库的分析表明，MRPL37在肝细胞癌组织中的表达显著高于正常肝组织。单细胞RNA测序数据(GSE149614和GSE166635)显示，MRPL37在癌细胞中高表达。Kaplan-Meier生存分析证实，MRPL37高表达患者的总生存期显著较差。时间依赖性AUC分析显示，基于MRPL37的预后模型比传统标志物具有更好的预测能力。免疫组织化学(IHC)分析和蛋白质印迹(WB)结果均验证了MRPL37在肝细胞癌组织中的上调表达。

进一步分析显示，MRPL37高表达与晚期病理T分期显著相关。肿瘤干性分析表明，MRPL37高表达组的mRNAsi评分显著更高。免疫分析显示，MRPL37高表达组中初始B细胞和CD4+记忆T细胞浸润显著减少，而M2巨噬细胞浸润显著增加。免疫检查点基因分析发现，CD274(PD-L1)和HAVCR2(TIM-3)等免疫逃逸基因在MRPL37高表达组中显著上调。TIDE分析表明，高表达患者具有更高的TIDE评分，提示对免疫检查点抑制剂的反应较差。

MRPL37在体外和体内促进肝细胞癌的肿瘤发生潜能

为研究MRPL37在肝细胞癌细胞中的致癌作用，研究人员在多种肝细胞癌细胞系中进行MRPL37敲低实验。选择MRPL37表达较高的JHH-7和SNU-398细胞系进行后续表型验证。CCK-8细胞增殖和克隆形成实验显示，MRPL37敲低显著抑制了肝细胞癌细胞增殖。细胞周期分析表明，沉默MRPL37诱导了G0/G1期细胞周期阻滞。凋亡实验显示，MRPL37敲低促进了细胞凋亡。挽救实验证实，在MRPL37敲低的肝细胞癌细胞中过表达MRPL37，可显著挽救受损的细胞增殖。

在体内实验中，肿瘤异种移植研究显示，MRPL37沉默显著抑制了肿瘤生长，肿瘤体积和重量均明显减少。在AKT-NRAS致癌基因驱动的C57BL/6小鼠自发肝癌模型中，MRPL37敲低显著损害了肝脏肿瘤形成，表现为肿瘤数量减少、体积变小。组织学分析显示，MRPL37敲低组的肿瘤负荷减轻。IHC分析进一步证明，MRPL37敲低组肝脏样本中肿瘤生物标志物CK-19和Ki67的表达水平显著降低。此外，沉默MRPL37还显著改善了肝功能，表现为血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平降低。

MRPL37与肝细胞癌细胞的氧化磷酸化和蛋白质合成密切相关

为探索MRPL37促进肝细胞癌细胞肿瘤发生潜能的机制，研究人员在MRPL37敲低的SNU-398细胞中进行了转录组和蛋白质组分析。RNA测序和差异表达基因(DEG)分析发现了83个上调和130个下调的MRPL37相关DEGs，表明MRPL37敲低在转录水平未引起显著变化。蛋白质组学分析鉴定出238个上调和278个下调的MRPL37相关差异表达蛋白(DEPs)。GO和KEGG通路分析显示，下调的DEPs主要富集在与OXPHOS、ATP合成与电子传递耦联等线粒体功能相关的生物过程中。基因集富集分析(GSEA)表明，MRPL37与OXPHOS和糖酵解/糖异生通路显著相关。

为进一步了解MRPL37如何影响线粒体功能，研究人员使用嘌呤霉素标记检测新生蛋白水平，评估MRPL37对蛋白质合成的影响。结果显示，MRPL37敲低显著降低了SNU-398和JHH-7细胞的新生蛋白水平。为验证MRPL37参与线粒体能量代谢，研究人员检测了六个关键线粒体能量代谢蛋白（MT-CO1、MT-ND2、MT-ATP6、MT-ATP8、MT-CYB和MT-CO2）的表达水平。qPCR和WB分析显示，MRPL37敲低不影响这些线粒体靶标的mRNA水平，但显著降低了这些线粒体蛋白的表达水平。

MRPL37敲低影响肝细胞癌细胞的线粒体功能

为进一步探索MRPL37对肝细胞癌细胞能量代谢的影响，研究人员在MRPL37敲低的SNU-398细胞中进行了靶向代谢组学分析。检测到的60多种能量代谢物中，16种上调，6种下调。值得注意的是，下调的代谢物包括关键线粒体代谢产物，如ATP、乙酰辅酶A和NAD+。差异丰度分析显示，MRPL37敲低导致与糖酵解/糖异生、碳代谢和TCA循环相关通路的代谢富集。ATP测定进一步证明，MRPL37敲低细胞中的ATP含量显著降低。

通过Seahorse分析仪评估OXPHOS和糖酵解，结果显示MRPL37敲低显著抑制了OXPHOS的多个关键方面，包括基础呼吸、最大呼吸、ATP生产和备用呼吸能力，表明对OXPHOS通路的深度抑制。相比之下，对糖酵解的影响较小，细胞外酸化率(ECAR)无显著变化。此外，MRPL37敲低导致线粒体膜电位显著降低。JC-1染色结果显示，shMRPL37处理组中JC-1聚集体与单体的比率显著降低，表明线粒体膜电位下降。

研究结论与讨论

本研究构建了基于MRPL基因家族的肝细胞癌亚型分类和预后模型，鉴定出MRPL37作为与肝细胞癌进展相关的关键基因。通过体外和体内实验结合多组学分析，揭示了MRPL37通过调控线粒体能量代谢和线粒体功能影响肝细胞癌恶性进展的新机制。

MRPLs对线粒体功能至关重要，特别是参与OXPHOS的蛋白质合成过程，而OXPHOS对细胞能量生产至关重要。MRPLs的失调可影响多种癌症（包括乳腺、卵巢、肺和肝癌）的细胞存活、增殖和转移潜能。本研究开发的二元风险模型基于MRPL家族基因表达，能有效预测高风险组的不良预后。该模型与细胞分裂、细胞周期和核糖体活性等关键细胞过程相关，也与肿瘤干性增加、免疫逃逸和化疗耐药相关。

MRPL37在肿瘤进展中的作用已在多种癌症类型中得到证实，但其功能因肿瘤而异。本研究发现在肝细胞癌中，MRPL37在多个肿瘤数据库中高表达，其高表达与肝细胞癌患者的不良预后相关。单细胞数据、WB和IHC均验证了其上调表达，提示其在肝细胞癌中的诊断和治疗价值。

本研究还揭示了MRPL37与其他MRPL家族成员之间的复杂相互作用。通过LASSO回归构建的预后模型包含了多个MRPL家族基因，强调了MRPL37与MRPL1、MRPL3、MRPL9、MRPL10、MRPL36、MRPL38和MRPL52的协同作用，以及与MRPL46和MRPL54的拮抗作用。单变量和多变量Cox回归分析均证实MRPL37具有最高的风险比，进一步确立了其作为肝细胞癌诊断和预后关键独立分子标志物的地位。

功能研究表明，MRPL37敲低导致肝细胞癌细胞增殖减少、细胞周期G0/G1期阻滞和凋亡诱导。在异种移植和自发肝癌模型中，MRPL37敲低显著抑制肿瘤生长，证实了其在肝细胞癌肿瘤发生中的关键作用。能量代谢和线粒体功能对癌细胞存活和增殖至关重要，本研究强调了能量代谢重编程在肝细胞癌中的重要性。MRPL37敲低导致的线粒体蛋白质合成和OXPHOS通路失调，引起肝细胞癌细胞中ATP生产的显著减少。

多组学数据和功能实验表明，MRPL37敲低影响了六个关键线粒体能量代谢蛋白的蛋白质水平，而不改变其mRNA水平，提示MRPL37可能在翻译水平直接参与线粒体蛋白质合成。本研究证明MRPL37通过调控线粒体蛋白质合成和OXPHOS，在肝细胞癌细胞的代谢转换中发挥关键作用。

总之，本研究提供了强有力的证据，表明MRPL37在调控肝细胞癌的线粒体功能、能量代谢和肿瘤进展中发挥关键作用。通过影响关键线粒体过程，MRPL37促进肝细胞癌进展并导致不良预后。这些发现表明MRPL37可能作为肝细胞癌的潜在治疗靶点，为开发针对线粒体功能和重编程肿瘤代谢的治疗策略奠定了基础。