NEXN通过靶向MYOCD调控Wnt/β-catenin信号通路影响肝细胞癌转移的机制研究

《iScience》：NEXN targeting MYOCD by facilitating EMT-related β-catenin nuclear translocation modulates the metastasis of hepatocellular carcinoma

　　本研究针对肝细胞癌(HCC)高转移性导致的预后差问题，通过临床样本分析、细胞实验和动物模型，首次揭示Nexilin F-actin binding protein(NEXN)作为肿瘤抑制因子，通过与心肌素(MYOCD)相互作用抑制β-catenin核转位，从而调控上皮-间质转化(EMT)进程。研究发现NEXN低表达与HCC患者不良预后显著相关，其过表达可抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力，为开发靶向Wnt通路的新型抑制剂提供了理论依据。

　　

肝细胞癌是全球范围内最常见的肝脏恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。据统计，到2050年全球新增病例预计将达到152万例。尽管手术切除和系统治疗取得了一定进展，但由于肿瘤的高度异质性和快速进展特性，肝细胞癌患者的五年生存率仍然徘徊在5%-30%之间。尤其值得关注的是，肿瘤转移是导致治疗失败和患者死亡的主要原因，而上皮-间质转化(EMT)在这一过程中发挥着关键作用。

Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。在肝细胞癌中，约30%的病例存在CTNNB1基因突变，8%存在Axin1/2基因突变，3%存在APC基因突变。当Wnt信号通路被激活时，β-catenin在细胞质中积累并转位至细胞核，与TCF/LEF转录因子结合，启动下游靶基因的表达，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。

Nexilin F-actin binding protein(NEXN)是一种肌动蛋白结合蛋白，最初被发现对心肌结构完整性至关重要。然而，NEXN在癌症中的作用却鲜为人知，尤其是在肝细胞癌中的功能和机制尚未明确。一些研究显示，NEXN在不同类型癌症中表达存在差异：在骨肉瘤中高表达与患者生存期缩短相关，而在甲状腺微小乳头状癌中表达水平低于正常组织。这种表达异质性提示NEXN可能在不同肿瘤中扮演着不同的角色。

为了解决这一科学问题，吴琼等研究人员在《iScience》上发表了最新研究成果，系统探讨了NEXN在肝细胞癌中的表达特征、生物学功能及其分子机制。

本研究采用了多种关键技术方法：通过对85对肝细胞癌及癌旁组织的免疫组织化学分析评估NEXN蛋白表达；利用TCGA数据库进行生物信息学分析和生存预后评估；通过慢病毒转染技术构建稳定过表达NEXN的肝细胞癌细胞系；采用细胞增殖、克隆形成、划痕愈合和Transwell实验评估细胞功能；建立裸鼠移植瘤模型进行体内验证；通过蛋白质组学筛选差异表达基因；运用蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光技术验证蛋白质相互作用；采用核质分离技术检测β-catenin的亚细胞定位。

Nexilin F-actin binding protein在肝细胞癌中低表达且与不良预后相关

研究人员首先检测了NEXN在肝细胞癌组织中的表达情况。免疫组织化学结果显示，NEXN在肝细胞癌组织中表达显著降低，且主要定位于癌细胞质中。配对分析进一步证实，大多数肝细胞癌患者的肿瘤组织中NEXN表达水平明显低于配对癌旁组织。TCGA数据库的mRNA水平数据也验证了这一发现，正常肝组织(n=160)中的NEXN表达显著高于肿瘤组织(n=371)。生存分析显示，NEXN低表达患者的总生存期(OS)、无病生存期(DFS)和无进展间隔期(PFI)均显著缩短。多因素Cox回归分析确定NEXN是影响肝细胞癌患者OS和DFS的独立预后因素。

Nexilin F-actin binding protein调控肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了探究NEXN的生物学功能，研究人员在Huh7和BEL-7402细胞系中构建了稳定过表达NEXN的细胞模型。实验结果表明，NEXN过表达显著抑制了肝细胞癌细胞的增殖能力，延长了群体倍增时间(PDT)。此外，NEXN过表达还明显抑制了细胞的克隆形成能力。在迁移和侵袭方面，划痕实验显示NEXN过表达降低了细胞横向迁移能力，而Transwell实验则证实了其对于垂直迁移和侵袭的抑制作用。恢复实验进一步证明，敲低NEXN可以逆转其过表达对细胞迁移和侵袭的抑制效应。

Nexilin F-actin binding protein过表达在体内抑制肝细胞癌细胞的致瘤性

通过裸鼠移植瘤模型，研究人员验证了NEXN在体内的抑瘤作用。实验结果显示，过表达NEXN的Huh7细胞在裸鼠体内形成的肿瘤体积显著减小，肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤重量也明显降低。免疫组织化学分析显示，NEXN过表达组肿瘤中Ki67核蛋白染色强度显著低于对照组，进一步证实了NEXN对肿瘤增殖的抑制作用。

Nexilin F-actin binding protein过表达通过抑制核β-catenin转位调控肝细胞癌上皮-间质转化

Western blot结果显示，NEXN过表达降低了间质标志物N-cadherin、β-catenin、Vimentin和MMP2的表达水平，而在BEL-7402细胞中还观察到了上皮标志物E-cadherin表达的上调。KEGG富集分析表明，NEXN表达与Wnt信号通路显著相关。进一步实验发现，NEXN过表达显著降低了β-catenin在细胞核中的积累，免疫荧光结果显示β-catenin主要定位于细胞膜和细胞质中。这些结果表明NEXN通过调控β-catenin的核转位来影响肝细胞癌的EMT过程。

Nexilin F-actin binding protein与MYOCD结合通过调控β-catenin核转位调节肝细胞癌上皮-间质转化过程

蛋白质组学分析发现，NEXN过表达上调了MYOCD的表达水平。TCGA数据库分析显示，MYOCD与NEXN表达呈强正相关(R=0.645)。实验证实MYOCD作为NEXN的下游效应分子发挥作用：MYOCD敲低可以逆转NEXN过表达对细胞克隆形成、迁移和侵袭的抑制作用，同时恢复间质蛋白的表达。蛋白质免疫共沉淀实验证实了NEXN与MYOCD之间存在直接相互作用，免疫荧光实验显示两者在细胞质中存在共定位。更重要的是，MYOCD敲低能够恢复β-catenin的核转位，表明NEXN通过MYOCD调控β-catenin的亚细胞定位。

Nexilin F-actin binding蛋白与MYOCD共同调控肝细胞癌预后

生存分析显示，MYOCD高表达患者具有更长的OS、疾病特异性生存(DSS)和PFI。联合分析发现，NEXN和MYOCD双高表达患者的预后最佳，显著优于其他表达组合的患者群体。

本研究首次证实NEXN作为一种肿瘤抑制因子，在肝细胞癌中低表达且与不良预后相关。机制上，NEXN通过结合MYOCD，抑制β-catenin的核转位，进而调控Wnt/β-catenin信号通路活性，影响上皮-间质转化过程，最终抑制肝细胞癌的转移。这一NEXN-MYOCD-β-catenin信号轴的发现，不仅丰富了我们对Wnt通路在肝细胞癌中激活机制的认识，而且为开发针对Wnt通路介导的转移抑制剂提供了新的靶点和 preclinical 基础。值得注意的是，NEXN和MYOCD的联合表达模式可作为肝细胞癌预后预测的重要生物标志物，为临床个体化治疗策略的制定提供了新的思路。

研究的局限性在于需要进一步寻找合适的肝细胞癌细胞系并建立裸鼠模型来深入理解NEXN在肝细胞癌复发和转移中的作用，同时需要更新随访数据来分析NEXN在转移性肝细胞癌中的表达情况。此外，NEXN与MYOCD在Wnt信号通路中的相互作用机制仍需更多探索。