低剂量率电离辐射通过超氧阴离子途径增强光敏剂单线态氧生成的新机制

《Cell Reports Physical Science》：Low-dose-rate ionizing radiation increases singlet oxygen production by photosensitizers

　　本研究针对光敏剂在电离辐射下单线态氧(1O2)生成机制不明确的问题，系统探究了氯e6(Ce6)在不同光子能量(X射线和60Co γ射线)和剂量率条件下的1O2产生规律。研究发现切伦科夫光并非1O2生成的必要条件，而超氧阴离子(·O2-)是关键中间体，低剂量率(0.005 Gy/min)可显著增强1O2产率。该机制为光敏剂在低剂量率放疗和放射性核素治疗中的优化应用提供了理论依据。

　　

在癌症治疗领域，放射治疗一直是重要的治疗手段之一，然而肿瘤复发问题始终困扰着临床医生。为了提高放疗效果，研究人员尝试使用放射增敏剂来增强肿瘤细胞对辐射的敏感性。传统放射增敏剂虽然能够延迟肿瘤生长，但其系统毒性限制了患者生存期的进一步延长。近年来，光敏剂(PSs)作为一种新型放射增敏剂引起了广泛关注，这类化合物在光动力疗法(PDT)中表现出卓越的产生活性氧(ROS)的能力，特别是单线态氧(¹O₂)的生成能力，使其在联合放疗时展现出巨大潜力。

尽管早期研究已经发现光敏剂与放射治疗联合使用能够诱导肿瘤消退，但其作用机制尚不明确。传统观点认为光敏剂需要通过吸收可见光光子激发到三重态，进而通过能量转移产生¹O₂。然而，电离辐射的能量远高于可见光，其激活光敏剂的机制可能完全不同。此外，先前研究对剂量率这一关键参数的关注不足，而剂量率在外部放疗与内部放射性核素治疗之间存在显著差异。

针对这些科学问题，荷兰代尔夫特理工大学的研究团队在《Cell Reports Physical Science》上发表了一项创新性研究，系统揭示了电离辐射激活光敏剂氯e6(Ce6)产生¹O₂的新机制。研究发现不仅挑战了传统认知，还为优化光敏剂在放射治疗中的应用提供了重要理论指导。

研究人员采用多种关键技术方法开展本研究：通过单线态氧传感器绿色(SOSG)探针和咪唑/对亚硝基-N,N-二甲基苯胺(Imd/RNO)检测法评估¹O₂生成；利用不同能量的X射线(最高310 kV)和⁶⁰Co γ射线(1.17和1.33 MeV)研究光子能量效应；系统考察剂量率(0.005-7 Gy/min)对¹O₂产率的影响；通过自由基清除实验(超氧化物歧化酶SOD)验证反应机制。所有实验均在严格控制的水相体系中进行，确保结果可靠性。

更高光子能量在可比剂量率下增强单线态氧生产

研究团队首先探究了辐射能量在激活Ce6中的作用，特别关注了切伦科夫光产生的可能性。他们使用两种外部辐射源——X射线和γ射线，分别提供不同能量的光子。使用的X射线能量为310 kV，不会产生切伦科夫光；而^{60Co源产生的γ射线能量(1.17和1.33 MeV)远高于切伦科夫光产生的限值。}

实验结果显示，在剂量率为6.2 Gy/min的γ射线照射下，Ce6组在5 Gy以上剂量时观察到荧光强度显著增加，在10和20 Gy时增强更为明显。为确证切伦科夫光非必要条件，研究人员在7 Gy/min剂量率下使用310 kV X射线照射样品，在20 Gy时Ce6组仍观察到荧光强度适度增加。经过数据标准化处理后，γ射线在10 Gy和20 Gy时均显示出显著差异，而X射线仅在20 Gy时出现显著增强。这些结果表明，切伦科夫光并非Ce6产生¹O₂的必要条件，且高能光子(γ射线)比低能光子(X射线)更能有效激活Ce6。

最低剂量率0.005 Gy/min导致最高单线态氧生产

基于上述发现，研究团队进一步探究了剂量率对¹O₂产生的影响，这一参数在外部和内部放射治疗中存在显著差异。考虑到放射性核素治疗中剂量率的不可预测性，本研究设置的最低剂量率为0.005 Gy/min，与低剂量率近距离放射治疗相当。

研究结果显示，在5 Gy X射线辐射下，剂量率为0.005 Gy/min时Ce6组的荧光强度增强最为显著，标准化相对增加达到2.505±0.026。相比之下，较高剂量率(7、3、0.2和0.05 Gy/min)下的值分别为1.361±0.108、1.413±0.115、1.416±0.131和1.580±0.024。统计分析表明，0.005 Gy/min时的标准化相对荧光强度显著高于较高剂量率。为验证SOSG结果，研究人员采用Imd/RNO方法进行补充实验，结果一致显示0.005 Gy/min剂量率下RNO吸收显著降低，而较高剂量率下未观察到显著变化。

超氧阴离子参与单线态氧形成

已有研究表明，水辐射分解产生的自由基可能在光敏剂激活过程中发挥作用。为探究自由基的作用机制，特别是超氧阴离子(·O₂^-)的作用，研究人员引入了·O₂^-清除剂超氧化物歧化酶(SOD)进行清除实验。

实验结果表明，添加1μg/mL SOD后，0.005 Gy/min剂量率下Ce6引起的SOSG荧光强度增加被完全消除，Ce6组与对照组之间无显著差异。同样，在Imd/RNO实验中，Ce6引起的RNO吸收降低也在SOD存在下被消除。在γ射线照射实验中，20 Gy辐射后Ce6组SOSG荧光强度显著高于对照组，但添加SOD后这种增加消失。这些结果强有力地证明了·O₂^-在Ce6产生¹O₂过程中的关键作用。

研究结论与讨论部分提出了创新的作用机制模型。与传统光敏化过程中三重态主导的机制不同，电离辐射激活Ce6主要通过自由基反应进行。研究人员提出，高能辐射导致Ce6自由基阳离子(Ce6^•+)的形成，这些阳离子随后与辐射诱导的·O₂^-反应产生¹O₂。该电子交换反应(方程式3：Ce6^•+ + ·O₂^- → Ce6 + ¹O₂)在热力学上是可行的，因为Ce6^•+的氧化电位估计在+0.9至+1.0 V(vs NHE)范围内，而·O₂^-氧化为¹O₂的氧化电位至少为+0.34 V(vs NHE)。

低剂量率下¹O₂生成增强的现象可通过动力学过程解释。在极低剂量率下，电离事件之间的时间延长使水合电子(e_aq^-)有更多机会与O₂反应，有利于·O₂^-的形成而非与其他自由基重组。这种·O₂^-可用性的增加增强了其与Ce6^•+的相互作用。在较高剂量率下，需要更高剂量才能达到相同的¹O₂产率，这可能是因为自由基形成密度增加促进了快速的重组反应，降低了·O₂^-形成及其与Ce6^•+后续反应的效率。

该研究的重要意义在于为光敏剂在放射治疗中的优化应用提供了理论指导。研究表明，低剂量率治疗方式如近距离放射治疗或放射性核素治疗，在与光敏剂联合使用时可能增强¹O₂产生。然而，研究人员也指出需要谨慎考虑细胞内抗氧化防御系统的复杂性、·O₂^-可用性以及剂量率依赖性细胞应答变化等因素。此外，·O₂^-参与该机制提示联合光敏剂-放射治疗的疗效可能受细胞氧化应激状态的影响，特别是在ROS水平升高和SOD活性降低的细胞中。

本研究首次系统揭示了剂量率对光敏剂产生¹O₂的影响，并明确了·O₂^-的关键作用，为放射动力学治疗提供了重要的机制见解。尽管需要在细胞环境中进一步验证这些效应，但该研究无疑为开发更有效的放射-光敏联合治疗策略奠定了坚实基础。