抗菌凝胶化粘附粉末的工程构建用于紧急止血与伤口愈合

《Cell Reports Physical Science》：Engineering an antibacterial gel-forming adhesive powder for emergency hemostasis and wound healing

　　针对现有止血粉剂在致死性非压迫性出血控制中存在的凝固慢、粘附差、细胞毒性及抗菌活性有限等问题，研究人员开发了一种由四臂聚乙二醇琥珀酰琥珀酸酯(Tetra-PEG-SS)、ε-聚赖氨酸(EPL)和壳聚糖微球(CMs)组成的抗菌凝胶化粘附粉末(SLC)。该粉末在应用时快速吸收液体并形成具有强粘附性的水凝胶密封，表现出优异的凝血性能、抗菌活性和生物相容性，在多种动物模型中优于商业止血剂，并能加速伤口愈合，为紧急止血和感染控制提供了创新解决方案。

　　

每年因创伤导致的大出血造成超过两百万人死亡，其中非压迫性出血在军事环境中占可存活死亡的90%，在平民创伤死亡中占30%-40%。虽然输血对稳定患者至关重要，但它不能止住活动性出血，在院前或战场等手术干预延迟或不可及的情况下尤其如此。目前已有的止血剂如止血带、生物粘附水凝胶、海绵、冷冻凝胶和粉末等各有局限：止血带对可外部触及的损伤有效，但不适用于无法直接加压的深部非压迫性伤口；生物粘附水凝胶在血液和渗出液存在下粘附性能受损；海绵和冷冻凝胶主要通过填塞效应止血，缺乏气密或水密密封能力。粉末止血剂因使用便捷、作用快速、培训需求低而备受关注，它们可直接应用于伤口，吸收血液、浓缩凝血因子并促进凝块形成。然而，当前市售的止血粉（如QuickClot、WoundStat、Celox和Arista）存在凝固速率慢、在凝血病条件下效果差、组织粘附性弱、甚至潜在的细胞毒性等问题，难以有效控制高压血流下的深部非压迫性出血。

粘附性凝胶化粉末作为一种有前景的替代方案，在接触血液或组织液时快速水化并发生原位凝胶化，形成粘附于组织表面的 cohesive 水凝胶。其多功能特性包括高效液体吸收、局部浓缩凝血因子、快速凝块形成以及形成坚固的防水水凝胶屏障，相比传统止血粉优势明显。为达成这些效果，研究人员探索了多种凝胶化机制，如氢键、静电相互作用、可逆希夫碱形成和共价交联等。尽管已有显著进展，但仍面临几个关键挑战：液体吸收不足会阻碍凝块形成，所得水凝胶可能缺乏足够粘附强度，在潮湿动态生理环境下无法维持稳定密封；生物安全性问题（如炎症反应或长期毒性）常被忽视，限制了临床适用性。克服这些挑战需要开发集高容量液体吸收、强组织粘附和良好生物相容性于一体并支持组织再生的先进设计策略。

感染性伤口由创伤或环境暴露引起，常延迟愈合、需额外干预并增加全身并发症（如脓毒症）风险。抗生素的广泛滥用加速了耐药菌株的出现。虽然重金属和天然提取物等替代抗菌剂显示出杀菌活性，但其潜在细胞毒性和活性成分消耗后效果递减限制了临床效用。光热疗法依赖外部光源且组织穿透有限，不适用于快速现场干预和深部伤口。相比之下，具有内在抗菌特性的止血材料通过提供持续、局部的抗菌作用，提供了更安全有效的解决方案，从而最小化抗生素耐药性风险。带季铵或胍基的阳离子聚合物和寡聚物（如壳聚糖、ε-聚赖氨酸(EPL)和聚六亚甲基胍）已被广泛纳入医用敷料以增强抗菌性能和支撑组织修复。作者团队此前报道了一种基于壳聚糖微球(CMs)、四臂聚乙二醇胺(Tetra-PEG-NH₂)和四臂聚乙二醇琥珀酰琥珀酸酯(Tetra-PEG-SS)的可凝胶化粘附粉末，虽然该配方表现出有效的止血性能，但其抗菌能力对于涉及感染控制和伤口愈合的临床高需求场景仍不够理想。

本研究设计了一种新型具有内在抗菌活性的凝胶化粘附粉末(SLC)，用于有效控制非压迫性出血并促进原位组织修复。该配方包含美国食品药品监督管理局(FDA)批准的Tetra-PEG-SS、天然阳离子多肽EPL和多孔壳聚糖微球(CMs)。应用于出血部位时，CMs快速吸收血液并促进凝固；同时，粉末水化触发Tetra-PEG-SS中的NHS酯基与EPL和CMs上丰富的胺基之间的共价交联，驱动快速形成 cohesive 水凝胶。界面液体的有效去除进一步促进了NHS酯基与底层富含胺的组织表面之间的化学键合，产生强而稳定的粘附。这种集成设计使粉末能转变为生物粘附水凝胶，实现对出血组织的 robust 止血密封，同时建立有利于伤口愈合的抗菌微环境。研究人员系统评估了SLC粉末的水触发凝胶行为、液体吸收能力、粘附密封强度、促凝血活性和抗菌功效；通过体外血液相容性和细胞相容性测定以及体内背部皮下植入研究评估生物相容性；在大鼠（肝部分切除和股动脉横断）和猪（肝/脾缺损和股动脉损伤）的各种损伤模型中验证粉末的体内止血功效，并与商业产品比较；最后利用大鼠全层皮肤伤口模型检验SLC促进原位伤口修复的能力，并研究组织再生的潜在机制。

关键技术方法包括：通过静电喷涂制备多孔壳聚糖微球(CMs)；将干燥的Tetra-PEG-SS、EPL和CMs按预定质量比涡旋混合制备SLC粉末；通过扫描电子显微镜(SEM)表征微观结构；进行液体吸收、压缩/拉伸力学测试、 lap shear 强度、180°剥离强度、爆破压力测试以评估物理化学性质；通过全血凝固时间、血凝指数(BCI)、红细胞/血小板粘附实验评估体外凝血能力；通过溶血实验、细胞活力实验和体内皮下植入评价生物相容性；通过菌落计数和扫描电子显微镜(SEM)评估抗菌性能；在大鼠肝部分切除、股动脉横断模型以及猪肝缺损、脾缺损、股动脉损伤模型中评估体内止血性能；在大鼠全层皮肤缺损模型中通过组织学染色（H&E、Masson）、免疫组化（TNF-α、CD31）评估伤口愈合效果。

RESULTS AND DISCUSSION

SLC的制备与物理表征

方案1展示了抗菌凝胶化粘附粉末的制备、机理和应用示意图。CMs通过静电喷涂制备，该技术相比传统乳液过程具有粒径控制更好、工艺简化、有机溶剂使用减少和可扩展性等优点。扫描电子显微镜(SEM)分析显示所得CM呈近球形，平均直径546.5微米，具有皱褶的孔壁和高度互连的多孔结构（孔隙率87.2%），这种结构有利于快速液体渗透、有效保水和增加表面接触。定量吸收测试表明CMs在水、PBS和血液中的吸收比分别达到2,246.3%、2,246.0%和2,242.4%，无显著差异，显示出出色且一致的液体吸收能力。

凝胶化粘附粉末SLC通过将干燥的Tetra-PEG-SS、EPL和CMs涡旋混合确保均匀分散而成。为便于系统评估，将具有不同Tetra-PEG-SS、EPL和CMs质量比(x:y:z)的配方命名为SLC-xyz。所有配方中Tetra-PEG-SS含量固定为20 wt%，以确保足够的反应性NHS基团用于快速凝胶化和强组织粘附。通过添加染红的水并在特定水粉质量比下评估粉末的水触发凝胶能力，随后用过量水评估凝胶的结构稳定性。系统评估凝胶行为重点关注两个变量比：Tetra-PEG-SS/EPL（4:1、4:2和4:4）和Tetra-PEG-SS/CM（4:8、4:4和4:2）。在Tetra-PEG-SS/EPL比为4:1时，SLC-412和SLC-414在水粉比10时30秒内形成稳定凝胶，但CMs含量最高的SLC-418在相同条件下未能凝胶，表明过量CMs可能阻碍凝胶过程。值得注意的是，当水粉比超过10时，没有配方能实现凝胶，表明在高水化度下凝胶效率有限。将Tetra-PEG-SS/EPL比增至4:2时，凝胶窗口变宽：在水粉比低于15时60秒内形成凝胶，且CMs含量越低凝胶越快。显著的是，SLC-422在水粉比5时5秒内凝胶，且是唯一在水粉比高达20时成功形成稳定凝胶的配方，凸显了其在高度水化条件下 superior 的凝胶能力。进一步将EPL含量增至4:4比例并未提高凝胶速度。基于这些发现，选择Tetra-PEG-SS/EPL比为4:2用于后续实验。这些结果表明通过调整EPL和CMs的比例可以微调SLC的凝胶性能：增加EPL含量或减少CMs含量通过促进Tetra-PEG-SS的NHS酯基与EPL和CMs中胺基之间更强的相互作用而提高凝胶效率，从而扩展有利于有效凝胶形成的水粉比范围。然而，应承认凝胶效率高度依赖于局部水粉比，这可能限制其在极端水化条件下的性能。

通过SEM检查所得SLC衍生水凝胶的内部微观结构。SLC-428呈现稀疏、松散缠绕的纤维网络，具有可见的CMs域和大量空隙，表明交联密度相对较低。随着CMs含量降低，纤维结构逐渐变得更加致密：SLC-424中观察到中等致密且互连的纤维结构，CMs部分嵌入周围聚合物基质中；相比之下，SLC-422显示密集交织的网络，CMs完全包封，孔径明显减小。这些观察表明降低CMs含量增加了交联密度并改善了水凝胶的结构均匀性。值得注意的是，在更高放大倍数下，观察到纤维穿透CMs的表面孔隙，表明聚合物链已扩散到微球的大孔结构中。这种互穿构型强调了协同增强机制：CMs与聚合物网络之间的物理缠结，以及通过胺化反应的化学交联，有助于增强水凝胶的结构完整性。

接下来评估SLC在水、PBS和全血中的液体吸收能力。平均吸收比从SLC-428到SLC-424和SLC-422逐渐降低（分别为1,775.9%、1,224.6%和1,010.7%），与水凝胶交联密度增加相关。有趣的是，水和血液中的吸收无显著差异，表明SLC在复杂生物环境中仍保持高效的液体吸收。值得注意的是，SLC粉末的液体吸收比相同质量比的Tetra-PEG-SS/EPL粉末高3-6倍。为进一步验证工程化CMs的贡献，使用原始壳聚糖粉末制备的配方显示液体吸收低于400%。这些结果强调了CMs在增强SLC液体吸收能力中的关键作用。此外，SLC在液体吸收方面优于商业止血粉，如Celox和云南白药(YB)。

通过压缩和拉伸测试表征不同CMs含量下工程化SLC衍生水凝胶的力学性能。压缩测试显示从SLC-428（75.0 kPa）到SLC-424（95.7 kPa）和SLC-422（127.9 kPa），压缩强度逐渐增加，伴随断裂应变改善。类似地，拉伸测试显示SLC-428、SLC-424和SLC-422的极限拉伸强度分别为4.9、17.0和22.8 kPa，与压缩结果一致。力学性能的这些增强可归因于CMs含量降低导致的交联密度增加，如SEM成像所证实。此外，粉末的形状适应性使其能模塑成各种水凝胶几何形状（如圆柱体、六边形、心形和矩形），凸显其适应不规则伤口表面并确保有效组织接触的潜力。作为演示，所得SLC-422水凝胶也表现出令人满意的机械韧性，能承受重复的轴向和径向压缩、拉伸、扭曲和弯曲而无机械失效。通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)表征SLC衍生水凝胶的化学结构，揭示了在1,745、1,640、1,573和1,102 cm^-1处的特征吸附带，分别对应O-C=O、酰胺I、酰胺II和C-O-C官能团。对CMs和SLC衍生水凝胶的N 1s高分辨率谱的补充X射线光电子能谱(XPS)分析识别出与伯胺(C-NH₂)、酰胺(N-C=O)和铵盐(C-NH₃⁺)相关的峰。与CMs相比，SLC衍生水凝胶显示出显著增加的N-C=O峰面积，这可归因于EPL中固有的酰胺基团以及NHS酯与胺基之间反应新形成的酰胺键。

SLC粉末的粘附密封评价

强组织粘附和安全伤口闭合对于实现气密或水密密封至关重要，从而防止止血粉和后续血凝块在动脉压力下脱落。首先进行扭转测试以评估SLC衍生水凝胶的粘附性能。当在存在水的情况下应用于离体猪皮肤时，SLC粉末快速吸收液体并在30秒内转变为水凝胶。形成的凝胶在弯曲、拉伸、扭曲和水冲洗等各种外部应力下保持完整性并牢固附着，表现出对湿组织表面的 robust 粘附。这种 robust 粘附源于Tetra-PEG-SS中NHS酯基与富含胺的EPL和CMs组分之间的自发反应，形成与组织表面伯胺共价键合的交联水凝胶网络，从而确保稳定锚定。为量化粘附强度，通过用水化粉末连接两片猪皮肤进行 lap shear 测试。所得粘合剂可支撑1 kg重量。值得注意的是，lap shear 强度随Tetra-PEG-SS含量增加而增加，从SLC-428的11.6 kPa增至SLC-424的25.5 kPa，并达到SLC-422的50.3 kPa。这些值是市售纤维蛋白胶（6.2 kPa）的2-8倍。对SLC衍生水凝胶的额外180°剥离和拉伸测试显示类似趋势，SLC-422实现最高界面韧性（93.9 J m^-2）和拉伸强度（46.3 kPa），分别优于纤维蛋白胶约10倍和6倍。显著的是，SLC-422的粘附性能超过了大多数最近报道的自凝胶粉末和粘附水凝胶。

为进一步评估密封性能，进行爆破压力测试以关键评估水凝胶在加压流体流下密封缺陷的能力。在猪皮肤上创建2毫米直径缺陷并用SLC衍生水凝胶密封。定制装置泵送PBS通过密封部位，记录密封失效时的内部压力作为爆破压力。CMs单独无法形成稳定密封并被迅速冲走。相比之下，SLC衍生水凝胶随着Tetra-PEG-SS含量增加表现出逐渐增强的密封能力。具体而言，具有最高Tetra-PEG-SS浓度的SLC-422实现最大爆破压力201.3 mmHg，显著超过纤维蛋白胶（52.7 mmHg）和正常人体动脉血压（≈120 mmHg）。这些发现证明了SLC-422作为加压动脉损伤粘附密封剂的强大潜力。

机理上，当沉积到湿表面时，粉末（尤其是多孔CMs）快速吸收界面流体，使组织表面脱水并确保紧密接触。这种脱水促进了水凝胶与组织之间 robust 化学交联的形成，这一过程与已建立的干交联机制一致。从SLC-428到SLC-422的粘附密封逐步增强主要由Tetra-PEG-SS含量的增加驱动，这促进了水凝胶形成和界面键合。SLC-422衍生水凝胶与猪皮肤的SEM成像显示具有连贯粘附界面的明显双层结构，证实了强界面粘附的形成。重要的是，液体吸收和组织脱水促进了游离聚合物链扩散到组织基质中，在胶原纤维内形成机械互锁，如高倍SEM图像中观察到的纠缠结构所证明。除了化学交联和机械互锁外，带正电的CMs和EPL组分与组织表面带负电基团之间的静电相互作用进一步增强了粘附。 collectively，SLC水凝胶的 robust 粘附源于组织界面处共价交联、机械互锁和静电相互作用的协同作用。鉴于其优异的密封能力结合良好的液体吸收，选择含有较高浓度Tetra-PEG-SS的SLC-422作为本研究剩余部分的优化配方。

SLC粉末的体外凝血能力

高效凝块形成对于实现快速止血至关重要。为评估SLC粉末的凝血性能，首先测量全血凝固时间。无任何止血剂（空白对照）时，稳定凝块形成需约7分钟。商业止血剂Celox和YB将其缩短至约5分钟，而CMs在120秒内实现更快凝固。显著的是，SLC粉末进一步加速凝块形成至30秒内，显示出 substantially 增强的促凝血效果。为定量评估凝血效率，进行动态全血凝固测定以确定血凝指数(BCI)，其中较低BCI值表示较强凝血活性。值得注意的是，孵育30秒后，SLC的BCI值为1.6%，显著低于CMs（29.6%）、Celox（73.7%）和YB（98.2%），表明其 superior 且快速的凝血能力。此外，SLC在所有测量时间点一致保持较低BCI值（<2%），确认其 robust 促凝血活性。为阐明CMs对此效应的贡献，比较了SLC与单独Tetra-PEG-SS/EPL粉末在不同血材质量比（2:1、5:1和10:1）下孵育30秒后的凝血性能。在所有测试比例下，SLC显示出显著低于Tetra-PEG-SS/EPL配方的BCI值，强调了CMs在增强凝血效率中的关键作用。

红细胞(RBCs)和血小板在血栓形成和止血中起 pivotal 作用。进一步进行血细胞粘附实验以检查粘附粉末的促凝血机制。定量分析显示SLC的RBC粘附比为77%，远超过CMs（53%）、Celox（30%）和YB（8%）。SEM成像显示与其他所有测试样品相比，SLC表面有更多RBCs和血小板粘附。YB和Celox较差的凝血性能可归因于其有限的液体吸收能力，如先前讨论。相比之下，CMs的高度多孔结构有利于高效血液吸收并浓缩血细胞。此外，带正电的壳聚糖通过静电相互作用吸引带负电的RBCs和血小板，加速凝血过程。在SLC粉末情况下，快速血液吸收触发原位水凝胶形成，从而在伤口部位浓缩血细胞、血浆蛋白和凝血因子， thereby 放大凝血级联。 collectively，SLC exceptional 的凝血性能源于壳聚糖内在促凝血特性、粉末快速高效血液吸收能力以及 upon 血液接触快速形成凝胶的能力的协同相互作用。

SLC粉末的生物相容性

生物安全性是止血材料开发和临床转化的基本前提。为评估SLC粉末的生物相容性，进行了全面评估，包括体外血液相容性和细胞相容性测定，以及体内背部皮下植入研究。在SLC浓度为10和30 mg mL^-1的溶血实验中，YB样品产生亮红色上清，类似于阳性对照（Triton X-100），表明明显溶血活性。相比之下，SLC和Celox组仅显示浅红色，类似于PBS阴性对照。定量分析显示SLC粉末的溶血比低于1.0%， well within 临床可接受阈值5%， demonstrating excellent 血液相容性。使用用SLC提取物培养的3T3小鼠成纤维细胞进一步评估细胞相容性。在整个3天孵育期间，细胞活力保持在95%以上。一致地，LIVE/DEAD染色显示几乎无死细胞（红色荧光），总体活力与未处理对照组相当，进一步验证了SLC粉末的细胞相容性。

接下来使用大鼠皮下植入模型在4周内评估SLC的体内生物相容性。在第7、14、21和28天回收植入物进行组织学检查。第7天的H&E和Masson染色显示大量单核炎症细胞募集，表明急性异物反应。然而，这种炎症反应逐渐消退，到第21天变为轻度，到第28天几乎解决。重要的是，在整个观察期间未观察到坏死、感染或其他不良病理变化迹象。此外，植入材料尺寸逐渐减小，表明渐进性体内降解。这种降解过程可能由壳聚糖的酶促水解和生理条件下琥珀酰酯键的裂解介导，如先前报道。此外，组织学切片显示细胞浸润到CMs网络中，表明组织整合和再生潜力。为评估全身生物安全性，对主要器官（心、肝、脾、肺和肾）进行组织学分析和血液学评估。与健康对照相比未检测到显著组织病理学变化或异常，确认无全身毒性。这些发现证实了SLC粉末 excellent 的生物安全性谱，支持其体内应用和长期植入潜力。

SLC粉末的体外抗菌特性

保护伤口免受细菌感染对于有效的急救伤口护理管理 highly desirable。为评估SLC粉末的抗菌活性，进行与大肠杆菌(E. coli)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的体外共培养实验，以CMs、Celox和CM/EPL复合物作为对照。孵育12小时后，涂板实验显示SLC和CM/EPL组中细菌菌落形成极少或无，表明强杀菌效果。定量分析显示CMs单独表现出 modest 抗菌活性，对E. coli和S. aureus的抗菌比分别达到39.6%和56.3%。这种有限功效可能源于CMs制备过程中形成的致密微晶网络，这可能阻碍材料表面与细菌细胞之间的直接接触。相比之下，CM/EPL复合物表现出 markedly 增强的抗菌活性，对两种细菌菌株的抑制比达到约99%，强调了EPL在介导杀菌效应中的 pivotal 作用。值得注意的是，SLC粉末表现出 comparable 抗菌功效（≈98%抑制），显著优于商业Celox，并 closely matching CM/EPL复合物的性能。

为阐明潜在抗菌机制，使用SEM检查细菌处理后的形态变化。与未处理组相比，暴露于SLC或CM/EPL的细菌细胞表现出严重的膜 disruption 和细胞内内容物泄漏。这些结构损伤主要归因于CMs和EPL中质子化的胺基，它们与带负电的细菌膜静电相互作用，导致膜 destabilization 和细胞裂解。EPL还被报道干扰细菌代谢，进一步加速细胞死亡。此外，SLC原位形成的水凝胶作为抵御细菌入侵的物理屏障。 together，这些作用赋予对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的 potent 抗菌活性，支持伤口管理中的有效感染控制。

SLC粉末的体内止血性能

创伤性肝损伤是钝性腹部创伤的常见后果，常导致非压迫性出血并带来 significant 临床挑战。为评估工程化SLC粉末的体内止血功效，首先采用涉及20毫米长切口的大鼠肝部分切除模型。以商业Celox和CMs粉末作为对照。记录总失血量和止血时间。在未处理损伤组中，发生严重出血，导致总失血1,273.6 mg，止血时间351秒。Celox和CMs处理将失血量分别减少至573.6和410.2 mg，平均止血时间缩短至约120秒。显著的是，SLC粉末优于两种对照，有效吸收血液并在70秒内实现快速止血，总失血量仅224.5 mg。

为在快速加压血流条件下进一步评估其性能，采用大鼠股动脉横断模型，这是一种模拟致命动脉出血的临床相关设置。在此模型中，施用手动压迫的医用纱布未能有效止住出血，导致过量失血3,868.9 mg。相比之下，SLC和Celox（均未手动压迫应用）在3分钟内成功控制出血。然而，虽然Celox最终止