基于计算与实验验证的海豚弹状病毒糖蛋白靶向新型scFv检测系统的开发与应用

《Heliyon》：Novel scFv detection system targeting the glycoprotein of harbor porpoise rhabdovirus (HPRV) through computational and experimental validation

　　本研究针对海豚弹状病毒(HPRV)缺乏有效检测方法的难题，开发了一种新型单链可变片段(scFv)检测系统。研究人员通过噬菌体展示生物淘选获得高亲和力scFv候选分子，结合分子对接、分子动力学模拟和ELISA验证，筛选出特异性靶向HPRV糖蛋白的G2 scFv抗体。该研究为海洋哺乳动物病毒诊断提供了高灵敏度、高特异性的新型检测工具，对海洋病毒防控具有重要意义。

　　

在广阔的海洋生态系统中，海洋哺乳动物如海豚和鼠海豚正面临着病毒感染的潜在威胁。其中，海豚弹状病毒(Harbor porpoise rhabdovirus, HPRV)作为一种新发现的病原体，因其独特的子弹状核衣壳结构和负链RNA基因组特征，引起了研究人员的密切关注。这种病毒不仅对海洋哺乳动物表现出细胞毒性效应，更令人担忧的是其可能存在跨物种传播和 zoonotic（人畜共患）传播风险。然而，目前针对海洋病毒，特别是鲸豚类动物病毒的诊断技术十分有限，传统方法如实时荧光定量PCR(RT-PCR)虽然灵敏，但无法满足现场快速检测和病毒中和应用的需求。这一技术空白严重制约了对HPRV传播机制、流行规律及其潜在公共卫生风险的深入理解。

为了解决这一难题，来自成均馆大学和韩国海洋科学技术院的研究团队将目光投向了抗体工程领域的新兴技术——单链可变片段(single-chain variable fragment, scFv)。这种由重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过短肽连接而成的微型抗体，因其分子量小、免疫原性低、特异性高、易于基因工程改造等优势，已成为病毒检测和抗病毒研究的有力工具。更重要的是，scFv可以在大肠杆菌系统中进行大规模生产，大大降低了生产成本，为海洋病毒诊断技术的推广应用创造了条件。

在这项发表于《Heliyon》杂志的研究中，研究人员成功开发了一种针对HPRV糖蛋白的新型scFv检测系统，并通过计算与实验验证相结合的方法，全面评估了其检测效能。研究团队采用多学科交叉的研究策略，主要运用了噬菌体展示生物淘选技术筛选高亲和力scFv候选分子，通过分子对接和分子动力学模拟计算分析抗体-抗原相互作用机制，利用ELISA（酶联免疫吸附测定）进行结合亲和力、特异性和灵敏度验证，同时通过圆二色谱（Circular Dichroism, CD）预测分析蛋白质二级结构变化。

2.1. scFv候选分子的筛选与序列分析

通过四轮噬菌体展示生物淘选过程，研究人员成功从人源scFv文库中筛选出能够特异性结合HPRV糖蛋白的候选分子。ELISA结果显示，随着淘选轮次的增加，scFv与抗原的结合能力显著增强，表明筛选过程有效富集了高亲和力的抗体片段。通过对筛选获得的scFv候选分子进行序列分析，研究人员鉴定出五个具有潜力的候选克隆（B2、F2、E3、G2和G8），其中G2和G8因具备完整的可变区结构而被选为重点研究对象。序列分析显示，这些scFv候选分子在互补决定区（Complementarity Determining Region, CDR）特别是CDR2和CDR3区域表现出丰富的多样性，这为其与抗原的特异性结合提供了结构基础。

2.2. 蛋白表达优化与纯化

为了获得高质量的scFv蛋白用于后续研究，研究人员对表达条件进行了系统优化。结果表明，在20°C条件下诱导表达18小时能够获得最佳的表达效果。通过Capto^TML树脂亲和层析技术，研究人员成功纯化出了G2和G8 scFv蛋白，Western blot分析证实了蛋白的正确表达和纯度。这一优化过程为后续的功能验证实验提供了可靠的材料保障。

2.3. 抗体-抗原相互作用的计算分析

研究人员通过同源建模构建了G2和G8 scFv以及HPRV糖蛋白的三维结构模型，并利用分子对接技术预测了它们之间的相互作用模式。对接结果显示，G2双结构域scFv与抗原的结合亲和力（ΔG = -11.2 kcal/mol）显著高于G8单结构域scFv（ΔG = -9.3 kcal/mol）。进一步的分析表明，scFv与抗原之间的相互作用主要由氢键和疏水作用介导，其中轻链可变区（V_L）在结合过程中发挥了更为重要的作用。

2.4. 分子动力学模拟验证结合稳定性

为了更深入地了解scFv与抗原结合的动态过程，研究人员进行了100纳秒的分子动力学模拟。模拟结果显示，G2双结构域scFv在与抗原结合后表现出更好的结构稳定性，其均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD）和回转半径（Radius of Gyration, R_g）的变化均小于G8单结构域scFv。结合能分析进一步证实，G2与抗原的结合更加稳定且强烈，这与其在实验观察中的优异表现相一致。

2.5. 圆二色谱分析二级结构变化

通过圆二色谱预测分析，研究人员发现G2 scFv在与抗原结合后，其二级结构发生了明显变化，β-折叠的比例有所下降，表明蛋白质在结合抗原过程中发生了构象调整。分子动力学模拟过程中不同时间点的光谱分析显示，G2在60纳秒时达到最稳定状态，而G8在20纳秒时即达到稳定状态，这一差异反映了两者在结构动态特性上的不同。

2.6. ELISA验证结合特性

功能验证实验表明，G2 scFv对HPRV抗原表现出高度的特异性和灵敏度。在特异性测试中，G2仅与HPRV抗原发生反应，而不与其他病毒抗原（如CDV、BwCoV、CaDV、TtPIV和HAV）或宿主蛋白（如Channa argus的肝脏、肌肉、鳃和肠道蛋白）发生交叉反应。灵敏度测试显示，G2能够检测到浓度低至2.5μg/mL的HPRV抗原肽，且其结合能力随抗原浓度的增加而增强，呈现明显的剂量依赖性关系。

本研究成功开发了一种针对海豚弹状病毒（HPRV）糖蛋白的新型scFv检测系统，并通过计算与实验相结合的方法验证了其有效性。研究结果表明，G2双结构域scFv在特异性、灵敏度和结合稳定性方面均优于单结构域scFv，是理想的诊断候选分子。这一研究成果不仅为海洋哺乳动物病毒诊断提供了新的技术手段，也展示了计算生物学在抗体设计和优化中的重要作用。

该研究的创新之处在于首次将计算模拟与实验验证相结合应用于海洋病毒scFv检测系统的开发。分子对接和分子动力学模拟不仅帮助研究人员深入理解了抗体-抗原相互作用的分子机制，还为scFv候选分子的筛选和优化提供了理论指导，大大提高了研究效率。此外，研究发现scFv与HPRV糖蛋白的结合主要依赖于轻链可变区（V_L）的相互作用，这一发现为未来抗体工程提供了重要的设计思路。

从应用前景来看，这种基于scFv的检测系统具有广阔的应用潜力。首先，由于其高特异性和灵敏度，它可以作为HPRV感染的早期诊断工具，有助于及时监测和控制病毒在海洋哺乳动物群体中的传播。其次，scFv的小分子特性和低免疫原性使其可能发展成为治疗性抗体，用于HPRV感染的治疗。此外，该技术平台可以扩展到其他海洋病毒的检测和中和研究，为海洋生态系统健康保护提供技术支持。

然而，研究人员也指出，目前的研究仍处于实验室阶段，未来需要在实际病毒样本中进行进一步验证。特别是需要将HPRV在细胞系中进行扩增，以评估scFv在真实感染情境下的检测效能。同时，对于scFv的中和活性及其在体内的稳定性和药代动力学特性，也需要进行更深入的研究。

总之，这项研究为海洋病毒诊断领域提供了新的思路和方法，展示了scFv技术在解决海洋环境健康问题中的巨大潜力。随着后续研究的不断深入，这种新型检测系统有望成为保护海洋哺乳动物和预防人畜共患病毒传播的重要工具，为海洋生态系统的可持续健康发展做出贡献。