BAM1/2通过磷酸化ABCG16调控其稳定性及ABA外排活性以抑制拟南芥根生长的分子机制

《Plant Communications》：BAM1/2-mediated Phosphorylation of ABCG16 Reduces its Stability and ABA Export Activity to Suppress Root Growth in Arabidopsis

　　本研究揭示了植物激素脱落酸（ABA）转运蛋白活性调控的新机制。为解决ABA转运蛋白如何被精确调控以平衡细胞ABA水平并影响根系生长这一关键问题，研究人员聚焦于受体样激酶BAM1/2与ABA转运蛋白ABCG16的相互作用。研究发现，BAM1/2能够磷酸化ABCG16的第45位苏氨酸（Thr45），此修饰降低了ABCG16的蛋白稳定性及其介导的ABA外排活性，从而维持了抑制根系生长所需的细胞ABA水平。该发现阐明了磷酸化依赖的ABA转运蛋白调控通路，为理解植物适应逆境的激素调控网络提供了重要见解。

　　

植物是固着生物，必须依靠其卓越的适应性来应对不断变化的环境挑战。在这个过程中，植物激素脱落酸（ABA）扮演着核心角色，它如同一位指挥官，在干旱、盐碱等胁迫条件下协调植物的应激反应。ABA要发挥其功能，关键在于其在植物体内不同组织和细胞间的动态分布与精准定位，而这一过程依赖于细胞膜上的各种ABA转运蛋白。近年来，研究发现ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族成员，特别是G亚族（ABCG）的多个蛋白，如ABCG25、ABCG40等，在ABA的转运中发挥着重要作用，从而调控气孔运动、种子萌发和干旱耐受性等多种生理过程。然而，科学家们对这些转运蛋白自身的活性是如何被精细调控的，尤其是翻译后修饰层面的调控机制，仍然知之甚少。

拟南芥中的ABCG16是一个近期被鉴定的具有双重功能的转运蛋白：它既能介导ABA从细胞质中外排，也能负责将ABA的葡萄糖酯（ABA-GE）转运至内质网（ER）或细胞核内。有趣的是，ABCG16同时定位于质膜（PM）和内膜系统（如内质网），这种独特的分布暗示其功能可能受到复杂的调控。那么，是什么机制在控制着ABCG16在不同膜结构之间的“穿梭”？其稳定性和转运活性又是如何响应ABA信号的呢？为了回答这些问题，来自南方科技大学的研究团队在《Plant Communications》上发表了他们的最新研究成果。

为了揭示ABA如何调控ABCG16，研究人员首先利用共聚焦显微镜观察了ABCG16在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。他们发现，ABCG16不仅与质膜和内质网标记共定位，还与反式高尔基体网络/早期内体（TGN/EE）标记蛋白SYP61-RFP的信号高度重叠，表明ABCG16参与了内膜系统的运输循环。更重要的是，当用ABA处理细胞后，ABCG16在质膜上的积累显著增加，而在内质网和TGN/EE上的信号则相应减少。这说明ABA能够主动地“引导”ABCG16更多地前往质膜，这可能有利于其执行ABA外排的功能。

接下来，研究团队将目光投向了可能调控ABCG16的“上游”因子。受体样激酶BAM1和BAM2（BARELY ANY MERISTEM 1/2）此前被报道参与ABA相关的生理过程。本研究发现，与ABCG16在ABA处理下表达量升高相反，BAM1和BAM2的表达在ABA处理下反而下降。表型分析显示，abcg16突变体对ABA介导的根系生长抑制表现出超敏感性（即根系生长受抑制更严重），而bam1;+/- bam2双突变体则对ABA不敏感（根系生长受抑制程度较轻）。这表明ABCG16负向调控ABA的根系生长抑制反应，而BAM1/2则正向调控这一过程，二者扮演着相反的角色。这提示BAM1/2可能通过调控ABCG16来影响ABA信号。

那么，BAM1/2和ABCG16之间是否存在直接的“对话”呢？答案是肯定的。体外Pull-down实验证实，BAM1/2的激酶结构域能够与ABCG16的N端片段直接结合。在植物细胞内，共聚焦显微镜观察和荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）分析均显示ABCG16与BAM1/2存在物理相互作用，并且这种相互作用不受ABA处理的影响。免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步在植物体内验证了它们的结合。

既然BAM1/2是激酶，它们是否会磷酸化ABCG16从而改变其功能？体外磷酸化实验表明，BAM1/2确实能够磷酸化ABCG16的N端区域。通过生物信息学预测和点突变实验，研究人员将磷酸化位点锁定在第45位苏氨酸（Thr45）。将Thr45突变为不能磷酸化的丙氨酸（T45A）后，BAM1/2介导的磷酸化信号显著减弱；而模拟持续磷酸化的谷氨酸突变（T45E）则影响了ABCG16的稳定性。细胞内的荧光强度分析和体外细胞降解实验均表明，BAM1/2介导的磷酸化会促进ABCG16通过26S蛋白酶体途径降解，从而降低了ABCG16的蛋白稳定性。换言之，BAM1/2就像一位“质检员”，通过给ABCG16“贴上”磷酸化标签，标记其需要被降解。

磷酸化修饰是否会影响ABCG16的核心功能——ABA转运呢？研究人员利用对ABA浓度敏感的荧光传感器（ABAleon2.1）进行了活细胞ABA转运检测。结果发现，表达野生型ABCG16或非磷酸化突变体ABCG16^T45A的细胞，其细胞质内的ABA水平较低，说明ABCG16促进了ABA的外排。然而，表达模拟磷酸化突变体ABCG16^T45E的细胞，其细胞质ABA水平与不表达ABCG16的对照组相似，表明磷酸化使ABCG16失去了ABA外排活性。更重要的是，在bam1;+/- bam2突变体的原生质体中（即缺乏BAM1/2激酶活性，ABCG16处于低磷酸化状态），即使不额外表达ABCG16，其基础ABA外排活性也高于野生型，这进一步证实了BAM1/2通过磷酸化来抑制ABCG16的转运活性。

这些分子水平的变化最终如何影响植物的根系生长？遗传互补实验给出了答案。在abcg16突变体中，回补野生型ABCG16或非磷酸化突变体ABCG16^T45A，都能使植株对ABA的根系生长反应恢复到野生型水平。但是，回补模拟磷酸化突变体ABCG16^T45E则无法挽救abcg16突变体的ABA超敏感表型。这意味着，ABCG16的磷酸化状态直接决定了其在调控根系生长中的功能。此外，遗传学上位性分析显示，abcg16 bam1和abcg16 bam2双突变体的表型与abcg16单突变体相似，都对ABA超敏感，这表明ABCG16在遗传上位于BAM1/2的下游执行功能。

本研究主要应用了以下关键技术方法：拟南芥原生质体分离与转染用于亚细胞定位和蛋白互作研究；共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）用于蛋白共定位分析；荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）用于验证体内蛋白互作及定量检测细胞质ABA浓度；体外Pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）用于验证蛋白直接相互作用；体外激酶实验用于鉴定磷酸化事件及位点；细胞降解实验用于评估蛋白稳定性；基于CRISPR/Cas9技术构建突变体并进行根系生长表型分析。

ABA介导ABCG16在内膜系统的空间分布

研究人员通过共定位实验发现，ABCG16不仅定位于质膜和内质网，还与反式高尔基体网络/早期内体（TGN/EE）标记存在共定位。ABA处理显著增加了ABCG16在质膜的积累，同时减少了其在内质网和TGN/EE的定位。这表明ABA能够调控ABCG16的膜靶向，可能将其导向执行ABA外排功能的主要场所——质膜。

BAM1/2以与ABCG16相反的方式调控拟南芥根系对ABA的响应

表型分析表明，abcg16突变体对ABA介导的根系生长抑制表现出超敏感性，而bam1;+/- bam2双突变体则表现出不敏感性。这说明ABCG16负向调控根系ABA反应，而BAM1/2正向调控该过程，提示二者可能存在功能上的联系。

BAM1/2与ABCG16相互作用

通过体外Pull-down、体内共定位、FRET-FLIM和免疫共沉淀等多种技术，研究证实了BAM1/2与ABCG16之间存在直接的物理相互作用，且这种相互作用不依赖于ABA处理。

BAM1/2主要在Thr45位点磷酸化ABCG16

体外激酶实验结合点突变技术证实，BAM1/2能够磷酸化ABCG16，其主要磷酸化位点是N端的第45位苏氨酸（Thr45）。ABA和渗透胁迫处理会减弱BAM1/2对ABCG16的磷酸化。

BAM1/2调控ABCG16的蛋白稳定性

细胞内荧光强度分析和体外降解实验表明，BAM1/2介导的磷酸化降低了ABCG16的蛋白稳定性，促进了其通过26S蛋白酶体途径的降解。在bam1;+/- bam2突变背景下，ABCG16的积累增加。

ABCG16在Thr45位点的磷酸化减弱其细胞质ABA外排能力并改变根系对ABA的响应

ABA转运实验显示，模拟磷酸化突变体ABCG16^T45E丧失了ABA外排活性，而非磷酸化突变体ABCG16^T45A则活性增强。在bam1;+/- bam2突变体中，ABA外排基础水平升高。遗传互补实验证明，ABCG16的磷酸化状态是其调控根系ABA反应所必需的。

BAM1/2与ABCG16在ABA介导的根系生长中的遗传上位性分析

遗传学分析表明，abcg16 bam1和abcg16 bam2双突变体的表型与abcg16单突变体相似，说明ABCG16在遗传上位于BAM1/2的下游，BAM1/2通过调控ABCG16来影响根系生长。

综上所述，本研究揭示了一条精细调控ABA转运蛋白ABCG16活性的磷酸化通路。在正常条件下，BAM1/2激酶通过磷酸化ABCG16的Thr45位点，促进其降解并抑制其ABA外排活性，从而有助于维持一定的细胞ABA水平。当ABA信号到来时，一方面ABA可能抑制BAM1/2的表达或活性，另一方面ABA直接促进ABCG16向质膜的运输，这两方面作用共同导致非磷酸化（或低磷酸化）的、稳定的ABCG16在质膜上积累，进而增强ABA外排，缓解根系生长抑制，使植物能够灵活调整生长以应对环境胁迫。这项工作首次将受体激酶BAM1/2、ABA转运蛋白ABCG16的磷酸化修饰、蛋白稳定性调控及其转运活性变化与植物根系生长发育的适应性反应联系起来，深化了对植物激素转运调控网络的理解，为未来通过遗传手段改良作物抗逆性提供了新的理论依据和潜在的分子靶点。