三倍体香附子染色体水平基因组组装揭示等位基因表达模式与除草剂抗性机制

《Plant Communications》：Chromosome-level genome assembly of triploid Cyperus rotundus uncovers allelic expression patterns and herbicide resistance mechanisms

　　本研究针对全球性恶性杂草香附子(Cyperus rotundus)缺乏基因组资源的现状，完成了首个三倍体香附子染色体水平基因组组装(875.13 Mb/165条染色体)，通过比较基因组学发现湖南种群(R-HN)对草甘膦和草铵膦产生双重抗性。研究证实草铵膦抗性由靶标基因GS2过表达介导，而草甘膦抗性则通过非靶标抗性机制实现，首次鉴定出CrABCG15和CrCASPL2C2两个功能基因。该基因组为理解三倍体杂草进化及抗性机制提供了重要资源，对研发靶向除草策略具有指导意义。

　　

在农业生产中，杂草竞争导致作物年平均减产超过20%，其中香附子(Cyperus rotundus)作为莎草科多年生草本植物，被列为全球最具入侵性和经济危害性的杂草物种之一。这种通过地下块茎快速繁殖的C₄植物，凭借其强大的竞争能力对水稻、玉米、棉花等主要作物造成严重威胁。然而，与许多作物及其野生近缘种相比，杂草物种的基因组学研究明显滞后，尤其对于三倍体香附子而言，缺乏高质量基因组资源严重制约了对其适应性和除草剂抗性机制的深入探索。

多倍化是植物基因组进化的重要驱动力，在杂草中尤为普遍。然而三倍体由于减数分裂不稳定性而较为罕见，其基因组特征和进化机制尚不明确。与此同时，除草剂过度使用导致抗性问题日益严重，其中草甘膦和草铵膦作为常用除草剂，在香附子防治中效果逐渐下降。抗性机制主要包括靶标位点抗性(TSR)和非靶标位点抗性(NTSR)，但香附子中这些机制的具体表现形式尚未阐明。

为解决这些问题，湖南农业大学潘浪团队与湖南省农业科学院等单位合作，在《Plant Communications》上发表了题为"Chromosome-level genome assembly of triploid Cyperus rotundus uncovers allelic expression patterns and herbicide resistance mechanisms"的研究论文。研究人员通过PacBio HiFi和Hi-C技术对采自云南的西双版纳种群(S-YN)进行基因组测序，获得了875.13 Mb的染色体水平组装，包含三个单倍型的165条染色体。通过比较来自中国不同地区的6个种群，发现仅湖南常德种群(R-HN)对草甘膦和草铵膦表现出双重抗性。

研究采用的主要技术方法包括：PacBio HiFi长读长测序与Hi-C染色体构象捕获技术完成基因组组装；比较基因组学和系统发育分析揭示进化关系；转录组测序(RNA-seq)分析基因表达差异；分子对接模拟预测蛋白-配体相互作用；酵母异源表达系统进行基因功能验证。样本来源涵盖云南、湖南、湖北、河南、浙江等地的农田生态系统，其中抗性种群R-HN来自长期使用草甘膦的蔬菜地。

基因组组装与注释

研究人员获得的基因组组装表现出高度的连续性和完整性，contig N50达到4.07 Mb，LAI评分在13.43-15.16之间，BUSCO完整度超过92.8%。基因注释共预测72,354个蛋白编码基因，其中51.57%的基因组序列由转座元件组成。三个单倍型hapI、hapII和hapIII的大小分别为289.15 Mb、278.23 Mb和270.09 Mb，各自包含23,362、23,007和22,736个基因，且表现出高度的共线性，没有发现重大染色体重排证据。

基因组进化分析

系统发育分析表明，香附子与油莎草(Cyperus esculentus)亲缘关系最近，约在1900万年前发生分化。基因家族分析显示，香附子有448个基因家族发生显著扩张，370个家族发生收缩。扩张家族主要富集在二萜类、黄酮类、泛酸和CoA以及类胡萝卜素生物合成等次级代谢产物合成途径，而收缩家族则主要参与内吞作用、泛素介导的蛋白水解以及淀粉和蔗糖代谢等基本细胞过程。正选择分析鉴定出80个受到选择压力的基因，这些基因主要与细胞生长死亡、运输分解代谢以及碳水化合物和维生素代谢相关。

R-HN种群的双重除草剂抗性

剂量反应实验显示，与其他种群相比，R-HN种群对草甘膦的抗性指数为2.47，对草铵膦的抗性指数为2.38，表现出明显的双重抗性特征。这一发现为后续抗性机制研究提供了重要的表型基础。

GS2过表达与草铵膦抗性

通过同源比对鉴定出三个GS2同源基因，位于三个单倍型的55号染色体上。表达分析发现，其中一个等位基因Cro69233在R-HN种群中显著上调表达，而其他同源基因表达无显著变化。RT-qPCR验证进一步证实了这一结果。重要的是，基因组DNA qPCR显示GS2基因拷贝数在S-YN和R-HN种群间无显著差异，表明抗性源于转录水平调控而非基因扩增。

等位基因表达模式分析

研究人员在三倍体基因组中鉴定出14,244个等位基因三联体，其中在S-YN种群中表达的有10,761个。表达模式分析发现，S-YN种群中64.5%的三联体呈现平衡表达模式，而R-HN种群中这一比例降至22.4%，同时显性表达和抑制表达模式的比例显著增加。这种表达模式的转变可能与除草剂选择压力相关，其中R-HN种群特有表达的688个三联体主要富集在应激反应通路。

草甘膦应答表达模式

通过分析草甘膦处理不同时间点的转录组数据，研究人员发现S-YN和R-HN种群对草甘膦的应答模式存在显著差异。在R-HN种群中，持续上调表达的基因簇与应激响应和代谢过程相关，而持续下调的基因则主要参与基本生物学过程。这种差异化的应答模式反映了抗性种群在应对除草剂压力时的独特调控策略。

CrABCG15和CrCASPL2C2的功能验证

从67个在R-HN种群中上调表达且对草甘膦有应答的基因中，研究人员筛选出5个候选基因进行功能验证。酵母实验表明，转入CrABCG15(编码ABC转运蛋白)和CrCASPL2C2(编码CASP样蛋白2C2)的酵母在45 mM和60 mM草甘膦条件下存活率显著高于对照，而CrLAC4则增加了酵母对草甘膦的敏感性。分子对接结果显示，CrABCG15和CrCASPL2C2与草甘膦的结合能分别为-3.32 kcal·mol^-1和-2.99 kcal·mol^-1，表明它们可能通过直接结合参与草甘膦的转运或代谢。

研究结论表明，香附子作为三倍体杂草，其基因组表现出独特的等位基因表达调控特性。草铵膦抗性主要由GS2靶标基因的过表达介导，而草甘膦抗性则通过NTSR机制实现，其中CrABCG15和CrCASPL2C2发挥着关键作用。这一发现不仅深化了对多倍体杂草适应机制的理解，也为开发新型除草策略提供了理论依据。值得注意的是，香附子还具有重要药用价值，其基因组资源将同时促进药用成分生物合成途径的研究。

这项研究的创新性在于首次提供了三倍体杂草的高质量基因组资源，揭示了等位基因表达动态在除草剂抗性中的重要作用，为理解多倍体植物的基因组进化与适应性提供了新视角。随着气候变化和除草剂抗性问题的日益严峻，该基因组将推动杂草生物学、作物-杂草互作等研究领域的发展，为可持续杂草治理策略的制定提供科学基础。