AAV8载体新型基因疗法HBVZ10：通过阻断cccDNA补充实现乙肝功能性治愈的突破性策略

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：HBVZ10, an AAV8 vector-based new HBV therapy candidate for cccDNA elimination

　　本研究针对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染中cccDNA难以清除的临床难题，开发了基于AAV8载体的基因治疗候选药物HBVZ10。该药物通过肌肉注射实现长期高效表达抗-HBs抗体（≥100,000 mIU/mL持续200天），联合恩替卡韦（ETV）可完全阻断病毒再感染通路，在uPA/SCID人源化肝小鼠模型中使cccDNA降低超100倍，并实现血清HBeAg和HBsAg转阴。该研究为缩短无限期核苷类似物治疗周期提供了全新策略。

　　

在全球范围内，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响着近3亿人，每年导致超过百万人死亡。病毒难以彻底清除的核心障碍在于细胞核内的共价闭合环状DNA（cccDNA）——它如同病毒的"遗传硬盘"，不仅顽固存在，还能不断复制新的病毒颗粒。现有主流药物核苷（酸）类似物（NAs）如恩替卡韦（ETV）虽能抑制病毒复制，却无法直接清除cccDNA，患者需终身服药，且停药后病毒极易反弹。

为什么cccDNA如此难以撼动？研究发现，其持久性依赖于两条关键补充途径：一是感染细胞内的"循环利用"（细胞内回收），即新合成的rcDNA可被补充进细胞核转化为cccDNA；二是细胞外的"重新感染"（de novo infection），即释放到细胞外的病毒颗粒感染新的肝细胞。尤其值得注意的是，当病毒感染进入后期，细胞内大量积累的病毒包膜蛋白会促使病毒颗粒大量分泌，此时细胞外再感染成为补充cccDNA的主要途径。然而，慢性乙肝患者体内产生的中和抗体（抗-HBs抗体）水平通常极低，无法有效阻断这一过程。

针对这一瓶颈，研究人员独辟蹊径，将治疗策略从"直接攻击cccDNA"转向"切断其补给线"。他们开发了名为HBVZ10的新型基因治疗候选药物。该药物采用优化后的腺相关病毒8型（AAV8）载体，能将编码人源抗-HBs抗体的基因递送至肌肉细胞，使其变身为长期的抗体"生产工厂"。一次注射，即可在免疫缺陷的uPA/SCID人源化肝小鼠体内实现持续200天以上、浓度超过10万mIU/mL的超高抗体表达。这一水平远超乙肝疫苗的保护阈值（12 mIU/mL）和临床治愈患者的平均水平，为彻底阻断病毒再感染提供了可能。

本研究的关键技术方法主要包括：利用uPA/SCID人源化肝小鼠模型建立HBV慢性感染；采用AAV8载体介导的基因递送技术实现抗-HBs抗体的体内长期表达；通过绝对定量数字PCR（ABQ dPCR）和qPCR精确检测肝组织内cccDNA和rcDNA水平；使用系列ELISA和Western Blot监测血清及肝内病毒抗原（HBsAg、HBeAg）和抗体的动态变化。

HBVZ10构建及表达抗体特性

研究人员基于已优化的AAV8载体平台构建了HBVZ10，其表达的抗体靶向HBsAg的"a"抗原决定簇，对ADR和ADW血清型显示出更强的结合力。在CD1免疫健全小鼠中，单次注射即可实现长达26周、浓度高达400μg/mL的抗体稳定表达。

体内表达水平、持续时间及功能

在uPA/SCID小鼠中，单次注射≥2.5×10¹⁰拷贝数的HBVZ10，抗体浓度可超过100,000 mIU/mL并维持至少200天。其长效表达机制在于AAV基因组在转导的肌细胞核内形成稳定的多联体结构。单药治疗虽能延缓病毒扩散、降低病毒载量和HBsAg水平，但完全应答率较低，提示需要联合用药。

部分阻断cccDNA补充的效果

当表达的抗体水平低于100,000 mIU/mL时，仅能部分阻断再感染，小鼠血清呈现HBsAg和抗-HBs抗体双阳性。此时，肝内cccDNA平均水平（0.2 copies/cell）虽显著低于未治疗组（0.5 copies/cell），但清除不完全。

完全阻断cccDNA补充的效果

研究的关键发现在于，当HBVZ10联合ETV使用时，既能通过ETV抑制细胞内rcDNA合成和回收途径，又能通过HBVZ10产生的高浓度抗体彻底阻断细胞外再感染途径。在这种"双管齐下"的策略下，17只小鼠实现了血清HBsAg转阴且抗-HBs抗体阳性。对其肝组织的380份样本分析显示，cccDNA平均水平降至0.0028 copies/cell，较未治疗组降低了超过100倍，甚至在部分小鼠中已检测不到cccDNA。

cccDNA清除的动力学证据

联合治疗组小鼠的血清HBeAg和HBsAg水平呈现进行性下降直至检测不到。由于HBeAg直接由cccDNA转录而来，其清除动态直观反映了肝内cccDNA库的缩减。同时，肝内rcDNA、HBsAg和HBcAg（乙肝核心抗原）水平也显著降低或转阴，从多个层面证实了病毒的有效清除。

预防停药后复发

在另一项实验中，研究人员模拟临床场景，在9周ETV治疗后停药。结果发现，单用ETV组停药后病毒迅速反弹，而"ETV+HBVZ10"联合治疗组在停药后长达16周的观察期内均未出现病毒学复发，并且血清HBeAg和HBsAg持续下降。这证明，建立持续高水平的中和抗体屏障，是防止停药后复发的关键。

本研究的重要结论在于，cccDNA并非传统认为的那样绝对稳定，其在感染肝细胞中会自然丢失，但其池子的稳定依赖于持续的补充。HBVZ10基因疗法通过一次给药即可建立持久的内源性抗体生产线，弥补了慢性乙肝患者抗体产生能力的缺陷。当与ETV等细胞内抑制剂联用时，能协同阻断cccDNA的两条补给线，将细胞自发的cccDNA丢失转化为高效的清除过程，最终实现肝内病毒储存库的深度清除。

这项研究的深刻启示在于，将治疗思路从"终身压制"转向"有限疗程的清除"是可行的。HBVZ10代表了一种全新的"细胞外阻断"模态，其作用不依赖于患者本身可能受损的免疫功能，为不同免疫状态的广大患者提供了普适性的治愈希望。该临床前证据有力地支持了HBVZ10作为一种极具潜力的乙肝新型疗法，其旨在通过短期联合用药实现功能性治愈的策略，有望彻底改变乙肝的治疗格局。研究成果发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》，为后续临床转化奠定了坚实的理论基础。