配体调控TERRA G-四链体对端粒DNA:RNA杂交体及ALT机制的影响研究

《Nucleic Acids Research》：Modulating TERRA G-quadruplexes with ligands: impact on telomeric DNA:RNA hybrids and ALT mechanisms

　　本研究针对TERRA（端粒重复序列RNA）G-四链体在癌症中的生物学功能尚不明确的问题，通过配体虚拟筛选发现FDA批准药物fedratinib、netarsudil和osimertinib可特异性稳定TERRA G-四链体。实验证实这些配体通过增加TERRA与端粒染色质结合，促进DNA:RNA杂交体形成，进而诱导端粒缺陷并激活ALT相关PML核体，揭示了TERRA G-四链体稳定化在端粒动态调控中的新机制，为癌症治疗提供了新靶点。

　　

在细胞生命活动的奥秘中，端粒如同染色体末端的"安全帽"，保护遗传信息在复制过程中不被磨损。这些特殊的核蛋白结构由简单的TTAGGG重复序列构成，但其功能远非如此简单。更令人惊奇的是，端粒本身还能被转录成一种名为TERRA（端粒重复序列RNA）的长链非编码RNA，它像一位神秘的调控者，在端粒保护和维持中扮演着关键角色。

然而，在癌细胞中，这种精密的调控系统常常出现异常。大多数癌细胞通过重新激活端粒酶来维持端粒长度，实现无限增殖；而约10%-15%的癌细胞则采用另一种更为复杂的机制——替代性端粒延长（ALT）途径。特别值得注意的是，TERRA在ALT阳性癌细胞中高度表达，被认为可能是启动ALT机制的关键因子。但由于缺乏有效的研究工具，TERRA在癌症进展中的具体作用及其作为治疗靶点的潜力一直模糊不清。

问题的核心在于TERRA和端粒DNA都能形成一种特殊的非经典结构——G-四链体（GQ）。这种由鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键形成的平面四重结构，在基因表达调控和基因组稳定性维持中发挥重要作用。TERRA G-四链体主要采用平行拓扑结构，成为特异性配体作用的理想靶点。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，研究人员开展了一项创新性的探索。他们通过配体虚拟筛选技术，从FDA已批准的药物中寻找能够与TERRA G-四链体特异性结合的化合物，并深入研究这些配体对端粒生物学功能的影响。

研究采用的主要技术方法包括：配体虚拟筛选鉴定TERRA G-四链体结合化合物；荧光置换实验和表面等离子共振技术评估配体与核酸结构的相互作用；圆二色谱分析G-四链体构象和热稳定性；免疫荧光与RNA/DNA荧光原位杂交技术检测细胞中TERRA定位和DNA:RNA杂交体形成；端粒荧光原位杂交分析染色体端粒异常；以及C-circle实验评估ALT活性。

TERRA G-四链体配体的鉴定与验证

研究人员通过配体虚拟筛选，从3000多种FDA批准药物中鉴定出15种潜在的RNA G-四链体结合剂。通过硫唑橙置换实验进一步验证，发现fedratinib、netarsudil、osimertinib、pranlukast和quercetin五种药物能够有效置换TERRA G-四链体上的荧光探针，其中前三种药物因具有明确的细胞靶点和抗增殖活性而被选为后续研究对象。

TERRA配体促进TERRA在端粒的定位

在U2OS细胞中，研究人员观察到这三种配体处理显著增加了TERRA与端粒标志蛋白TRF2的共定位信号，表明配体能够促进TERRA在端粒区域的富集。实时定量PCR和Northern blot分析进一步证实，fedratinib、osimertinib和阳性对照BPBA能够提高TERRA的表达水平，提示G-四链体稳定化可能保护TERRA免受降解。

TERRA G-四链体配体与端粒DNA:RNA杂交体的相互作用

通过免疫荧光与DNA荧光原位杂交技术，研究发现这些配体处理显著增加了端粒区域DNA:RNA杂交体的形成，这一现象在ALT阳性的U2OS细胞和端粒酶阳性的HeLa细胞中均得到证实。RNAseH1处理可特异性消除这些杂交体信号，验证了检测的特异性。此外，利用GFP标记的RNAseH1（RHINO质粒）作为体内R-loop标记物，研究人员进一步确认了配体诱导的端粒R-loop增加。

DNA:RNA杂交G-四链体的表征与配体结合特性

研究团队设计了一种嵌合DNA-RNA寡核苷酸（HGQ24）作为DNA:RNA杂交G-四链体模型。圆二色谱分析显示HGQ24形成平行的G-四链体结构，热稳定性介于TERRA和端粒DNA G-四链体之间。表面等离子共振实验证明BG4抗体能有效识别HGQ24，亲和力与TERRA G-四链体相当。配体结合实验表明，osimertinib对HGQ24表现出较高亲和力和稳定效果，而fedratinib和netarsudil也显示出一定的结合特异性。

TERRA配体诱导端粒缺陷和ALT表型

端粒荧光原位杂交分析显示，配体处理导致脆性端粒、端粒游离末端和染色体外端粒信号等端粒异常显著增加。特别值得注意的是，染色体末端融合频率的升高支持了TERRA在姐妹染色单体分离中的作用假说。这些效应在RNAseH1过表达细胞中被显著抑制，表明DNA:RNA杂交体的形成是配体诱导端粒缺陷的关键机制。

TERRA配体增强ALT活性

研究人员发现fedratinib、netarsudil和osimertinib处理显著增加了ALT相关PML核体的形成，表明ALT重组活性增强。C-circle实验进一步证实，fedratinib和osimertinib能够促进ALT特异性标志物C-circle的积累。重要的是，RNAseH1的过表达完全阻断了配体诱导的APB形成，证明TERRA稳定化和DNA:RNA杂交体形成是ALT激活的必要条件。

100. The statistical significance was calculated using the Mann-Whitney test(P<.05;P<.01;P<.001;*P<.0001).(D,E):C-circle assay.In U2OS cells treated with the IC50 dose of the indicated compounds for 48 h,genomic DNA was extracted, and rolling circle amplification was performed with Phi DNA polymerase. The fold change in telomeric DNA content(normalized to single copy gene determined DNA content) was calculated for Phi-amplified versus nonamplified DNA samples and reported as histograms. Results represent the mean of three independent experiments(shown as individual points in the graph), with bars denoting SD. Statistical significance was calculated with the paired t-test(P<0.05).'>

本研究通过系统性分析揭示了TERRA G-四链体稳定化在端粒生物学中的多重作用。研究发现，fedratinib、netarsudil和osimertinib这些FDA已批准药物能够作为TERRA G-四链体的有效配体，通过稳定TERRA与端粒染色质的结合，促进DNA:RNA杂交体形成，进而诱导端粒复制应激和染色体异常。更重要的是，这种作用在端粒酶阳性和ALT阳性细胞中均能诱导ALT样表型，表明TERRA G-四链体稳定化可能是连接不同端粒维持机制的共同通路。

这些发现不仅深化了我们对TERRA生物学功能的理解，更重要的是揭示了G-四链体配体治疗的新机制和潜在风险。一方面，TERRA G-四链体作为癌症治疗靶点的可行性得到实验支持，为开发新型抗癌策略提供了方向；另一方面，这些发现提示临床上使用的某些靶向药物可能通过影响端粒稳定性而产生基因组不稳定的副作用，这在药物安全评价中需要高度重视。

该研究的创新性在于首次系统阐述了TERRA G-四链体配体通过DNA:RNA杂交G-四链体调控端粒稳定性的分子机制，为理解非编码RNA结构在基因组稳定性维持中的作用提供了新视角，也为开发针对端粒生物学的新型治疗策略奠定了重要基础。