3D打印微柱阵列实现高通量寡核苷酸合成的纳米级规模化制备

《Scientific Reports》：Fabrication of microcolumn arrays for high-throughput oligonucleotide synthesis using 3D printing

　　本研究针对平面寡核苷酸阵列合成规模受限（飞摩尔级/特征）与柱式合成通量低的矛盾，开发了一种基于LCD 3D打印的微柱阵列基底。通过筛选耐化学性光敏树脂（Deep Blue）、优化打印参数（添加Sudan Orange G抑制光散射、黑色玻璃基板减少反射），成功制备了孔径<70μm、可固定CPG（可控孔玻璃） beads的微柱结构。该基底结合了阵列的高密度（1cm2内324个微柱）与柱式的单特征高产出（155.2fmol/柱），通过喷墨递送磷酰胺单体，实现了15-mer poly(dT)的并行合成（步骤效率96.23%），单次合成总产量达705.5ng。该技术为DNA数据存储、合成生物学等需大量寡核苷酸的应用提供了低成本（0.12美元/基底）、可扩展的解决方案。

　　

在合成生物学、基因组学和DNA数据存储等领域，寡核苷酸库已成为不可或缺的工具。然而，传统的寡核苷酸合成方法面临一个两难选择：平面阵列技术（如光刻法、喷墨打印）能够并行合成数千至数百万条序列，但每个特征的合成规模仅停留在飞摩尔（femtoscale）级别，难以满足下游应用对DNA量的需求；而柱式合成（如96孔板格式）虽能实现纳摩尔级产出，却受限于低通量和大量试剂消耗。更棘手的是，平面阵列的微缩化会加剧边缘效应和定位误差，导致序列错误率上升。如何兼顾高通量与大规格合成，成为该领域亟待突破的瓶颈。

为解决这一难题，延世大学（Yonsei University）的Haeun Kim、Junhyeong Kim和Duhee Bang研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究。他们利用LCD 3D打印技术，设计了一种微柱阵列基底，巧妙地将阵列的高密度布局与柱式合成的三维反应环境相结合。该基底通过微米级孔洞固定CPG beads，使每个微柱成为独立的合成单元，既实现了高通量并行合成，又将单特征产出提升至亚纳摩尔级。研究团队从材料筛选、打印优化到功能验证逐步推进，最终成功在包含1000个微柱的阵列上合成了15聚体poly(dT)，证明了该平台的可行性与规模化潜力。

关键技术方法

研究首先筛选了8种商用光敏树脂的耐化学性（暴露于二氯乙酸、乙腈等合成试剂），选定Deep Blue树脂并添加Sudan Orange G以抑制UV过固化。随后优化打印参数（UV强度80%、曝光时间13秒、层厚50μm），并采用黑色玻璃基板减少光散射，实现66μm微孔的高保真打印。功能验证通过定制喷墨合成仪完成，CPG beads填充后，通过真空抽吸实现试剂全局流动，喷墨精准递送磷酰胺单体，最终通过尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）和光谱法量化合成产物。

结果

筛选光敏树脂的耐化学性

通过浸渍实验发现，未充分后固化的树脂在试剂中易发生溶胀、开裂等变形。延长后固化时间至2小时后，Deep Blue树脂表现出最优稳定性，在所有试剂中重量变化均<2%，且无可见损伤，满足精密合成对基底形变的最小化要求。

优化3D打印参数

微孔打印的关键在于控制UV固化精度。添加UV吸收剂后，13秒曝光可形成58.7μm孔径的开放微孔，而14秒曝光导致孔洞闭合。采用黑色玻璃基板进一步消除了金属基板的漫反射干扰，使微孔成功率达到100%，且基底表面光滑疏水，利于试剂定向吸收。

DNA合成与功能验证

CPG beads（1-3颗/柱）被稳定固定在微孔中，无泄漏。15-mer poly(dT)合成后，Urea-PAGE显示主条带为目标产物，截断序列占比39.3%，步骤耦合效率达96.23%。总产量705.5ng对应单柱产量155.2fmol，较平面阵列提升3-6个数量级。

结论与意义

该研究通过3D打印微柱阵列，成功融合了平面阵列的高通量与柱式合成的高产出优势。基底的疏水表面与亲水CPG形成的浸润差异，降低了喷墨定位精度要求，减少了交叉污染。尽管当前合成效率略低于商用仪器（通常>99%），但该平台以极低的成本（0.12美元/基底）和短制备周期（2.5小时），为实验室级寡核苷酸规模化合成提供了新思路。未来通过测序验证空间合成均匀性、优化树脂生物相容性（如采用全氟聚醚），可进一步拓展至RNA、多肽合成等固相反应场景，彰显了3D打印在生物制造中的广泛应用前景。