登革热中低密度粒细胞与中性粒细胞胞外诱捕网的作用：干扰素α和细胞游离DNA的影响

《Scientific Reports》：Low-density granulocytes and neutrophil extracellular traps in dengue, impacts of interferon alpha and cell-free DNA

　　本研究针对登革热早期预警标志物缺乏的问题，探讨了低密度粒细胞(LDGs)和中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在疾病严重程度区分中的作用。研究人员发现，在无预警症状(DWoWS)和有预警症状(DWWS)的登革热患者中，NETs相关参数(血清细胞游离DNA和PMN分数中的荧光染色)在DWWS组显著更高，而LDGs和血清细胞因子(IFN-α、TNF-α、IL-6)无差异。体外实验证实IFN-α和细胞游离DNA可诱导NETs形成和LDGs转化。该研究为登革热严重程度的早期预测提供了新的潜在生物标志物。

　　

登革热是一种由蚊子传播的病毒感染，其临床表现范围广泛，从良性发热性疾病到伴有血小板功能障碍和血管渗漏的严重感染。严重登革热的关键阶段通常发生在发热后的第3至第7天，其特征是血液浓缩（hematocrit, Hct）升高超过20%，这源于受损血管的血浆泄漏。尽管并非所有登革热患者都会出现血液浓缩，但其存在标志着疾病进入需要密切监测和管理的危重阶段。目前，预测严重的血液浓缩对于及时准备支持性护理至关重要。登革热诱导的血液浓缩和血管损伤机制与促炎细胞因子和先天免疫细胞（如中性粒细胞和单核细胞）相关，因此先天免疫参数作为登革热生物标志物引起了研究人员的兴趣。

然而，关于登革热中先天免疫的数据仍然较少，且已知的细胞因子生物标志物（如干扰素α (IFN-α)）在不同研究中存在不一致性，部分原因是登革热病毒具有减少IFN-α产生的逃避策略。此外，由于细胞因子的冗余性（不同细胞因子诱导相似效应），使用单一或一组细胞因子作为严重程度生物标志物可能存在困难。因此，非细胞因子参数可能更具吸引力。中性粒细胞是人体中最丰富的先天免疫细胞，在感染早期控制病毒载量方面发挥着重要作用。中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）是活化的中性粒细胞释放的胞外DNA网络，其在登革热中的形成已有报道。低密度粒细胞（Low-Density Granulocytes, LDGs）则是在通过梯度分离程序分离的血样中，存在于外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）分数中的中性粒细胞，其密度与淋巴细胞和单核细胞相似，但低于常规中性粒细胞。LDGs与2019冠状病毒病（COVID-19）和流感的严重程度呈正相关，并且与NETs一样，可由I型干扰素（先天免疫中的重要细胞因子）诱导。

基于此，研究人员假设，在登革热中，LDGs和NETs可能由细胞因子组合诱导，并且可能出现在血液浓缩之前。为了验证这一假设，他们开展了一项研究，旨在探索登革热发热第5天（排除已发生血液浓缩的患者）的LDGs和NETs，并进行了体外实验来验证IFN-α和细胞游离DNA（cell-free DNA）的作用。该研究结果发表在《Scientific Reports》期刊上。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：研究采用横断面设计，招募了登革热患者（分为无预警症状DWoWS和有预警症状DWWS组）和健康对照。血液样本在发热第5天采集。关键技术包括：使用密度梯度离心法分离外周血单核细胞（PBMC）和多形核细胞（PMN）分数；通过Wright's Giemsa染色对PBMC分数中的LDGs进行计数；使用Quant-iT? PicoGreen试剂盒定量血清细胞游离DNA；通过免疫荧光染色（针对中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）和瓜氨酸化组蛋白3（CitH3））和DAPI核形态观察来评估PMN和PBMC分数中的细胞外诱捕网（ETs，包括NETs）；并通过体外实验，用重组人IFN-α2和从健康志愿者提取的细胞游离DNA刺激健康志愿者的中性粒细胞，随后再次进行密度梯度分离以区分LDGs和常规密度粒细胞（RDGs），并利用流式细胞术分析细胞活性标志物CD66b和凋亡/坏死情况。

LDGs和血清IFN-α在DWWS与DWoWS间无差异

为了探索登革热危重期（发热第4至第7天）的LDGs和NETs，研究人员在排除了有明显血液浓缩的严重登革热患者后，于发热第5天采集了血液样本。研究共分析了19名健康志愿者、40名无预警症状登革热患者（DWoWS）和31名有预警症状登革热患者（DWWS）。结果显示，在血常规参数（血红蛋白、Hct、白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞）方面，DWoWS和DWWS组之间没有差异。尽管登革热患者的非典型淋巴细胞较高且血小板计数较低，但DWoWS和DWWS组间的非典型淋巴细胞无差异。然而，DWWS组的中性粒细胞杆状核比例升高。在肝功能酶方面，只有DWWS组的丙氨酸转氨酶（ALT）高于健康对照，而天冬氨酸转氨酶（AST）无差异。血清细胞因子分析显示，登革热患者的IFN-α和IL-6水平高于健康对照，但DWoWS和DWWS组间无差异。而血清TNF-α在DWWS组（而非DWoWS组）高于健康对照。这些结果表明，在排除了血液浓缩的发热第5天患者中，常规实验室指标和血清IFN-α水平无法区分DWWS和DWoWS。

DWWS患者在PMN和PBMC分数中表现出更显著的NETs和ETs

通过密度梯度离心分离后，研究人员测定了血清中的细胞游离DNA，并分别评估了PBMC分数中的LDGs和PMN分数中的NETs。结果显示，登革热患者PBMC分数中通过Wright's染色确定的LDGs百分比高于健康对照，但DWoWS和DWWS组间无差异。登革热患者的血清细胞游离DNA水平高于健康对照，并且在DWWS组比DWoWS组更为显著。对于PMN分数中的NETs，通过多种方法（DAPI核形态、抗NE、抗MPO和抗CitH3免疫荧光）评估，均显示登革热患者的NETs高于健康对照，且DWWS组显著高于DWoWS组。NETs（通过DAPI评估）与LDGs、NETs与细胞游离DNA、以及LDGs与细胞游离DNA之间的相关性分析显示决定系数（R2）较低，表明各组参数间相关性有限。由于PBMC分数中的LDGs也能产生NETs，研究人员进一步探索了PBMC分数中的细胞外诱捕网（ETs）。结果显示，健康对照的PBMC分数中未检测到ETs（通过NE和MPO染色），而DWWS组的ETs显著高于DWoWS组。这表明，登革热的预警症状可能与PMN分数（中性粒细胞的ETs）或PBMC分数（LDGs和单核细胞的ETs）中的ETs相关，中性粒细胞相关参数可能是判断登革热严重程度的有趣生物标志物。

IFN-α和细胞游离DNA对NETs和LDGs的影响

由于细胞游离DNA和NETs是能够区分DWoWS和DWWS的参数，并且IFN-α和细胞游离已知可激活中性粒细胞，研究人员推测两者可能在感染过程中促使中性粒细胞转化为NETs和LDGs。体外实验中，他们用IFN-α、细胞游离DNA以及两者组合刺激来自健康对照的中性粒细胞，然后再次测定细胞密度（梯度分离）和进行免疫荧光染色（NETs）。结果显示，IFN-α、细胞游离DNA及其组合在刺激1.5小时后均能诱导NETs形成，而组合刺激比单个因子更能诱导LDGs的产生。流式细胞术分析显示，与对照组相比，LDGs和RDGs中CD66b（一种粘附分子）的表达更高，表明刺激后的中性粒细胞活性增强；且LDGs中的CD66b表达高于RDGs，意味着LDGs的活性更强。同样，IFN-α和细胞游离DNA在LDGs和RDGs中均诱导了晚期凋亡和坏死（细胞死亡），且LDGs中的细胞死亡比RDGs更显著，表明LDGs承受的细胞应激更严重。此外，IFN-α和细胞游离DNA在RDGs和LDGs中诱导的NETs水平相似。因此，IFN-α和细胞游离DNA能显著诱导中性粒细胞形成NETs，且不受细胞密度（LDGs和RDGs）的影响。这种激活作用可能是患者体内PBMC分数中显著NETs和ETs的原因。

本研究结论与讨论部分指出，在登革热发热第5天且无血液浓缩的患者中，只有细胞游离DNA和ETs（无论来自PMN还是PBMC分数）能够区分DWoWS和DWWS，而LDGs和血清IFN-α则不能。尽管DWWS组的中性粒细胞杆状核和ALT高于健康对照，但它们与DWoWS组无差异。升高的杆状核中性粒细胞和血清细胞因子（IFN-α、TNF-α、IL-6）支持登革热中存在先天免疫激活。由于细胞因子的冗余性，细胞因子刺激的结果（如先天免疫细胞的激活）可能比单个细胞因子是更好的生物标志物。中性粒细胞作为最丰富的免疫细胞，其激活状态因此被关注。研究发现，虽然LDGs和NETs在登革热中均比健康对照显著，但只有NET相关参数能区分疾病严重程度。细胞游离DNA可能来源于细胞损伤或肠道通透性改变导致的细菌DNA易位，并可能通过增强凝血酶和抑制纤溶来对抗登革热诱导的凝血病。登革热病毒非结构蛋白1（NS1）也可通过血小板激活直接诱导NETs。本研究支持细胞因子（如IFN-α）和细胞游离DNA至少部分参与了登革热中LDG的转化。尽管PBMC分数中的LDGs本身不能区分DWWS和DWoWS，但PMN和PBMC分数中的ETs可以。PBMC分数中的ETs可能是NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成）和METosis（单核细胞胞外诱捕网形成）的组合。由于两者都能产生细胞游离DNA，因此测定血清细胞游离DNA可能比分离细胞测定ETs更为便捷。研究还揭示了IFN-α和细胞游离DNA在诱导LDG方面的叠加效应，以及LDGs比RDGs具有更高的活性（CD66b表达）和细胞应激。然而，两者诱导NETs的能力相似。这些发现提示，在登革热中可能存在类似自身免疫疾病的LDGs和NETs的恶性循环损伤机制。

该研究的重要意义在于揭示了中性粒细胞活化（包括LDGs、NETosis和凋亡）与登革热疾病活动的相关性，提示ETs（在PMN或PBMC分数中）和血清细胞游离DNA可能作为有价值的指标，用于在血液浓缩发生前预测登革热的预警 signs。虽然LDGs的粗略测定（通过梯度离心和Wright's染色计数PBMC分数中的中性粒细胞百分比）无需昂贵流式细胞仪，可能在资源有限医院有应用潜力，但其在本研究中区分严重程度的能力有限，未来需要更多研究来探索其临床用途。此外，研究也存在一些局限性，如排除了血液浓缩患者导致比较组临床特征差异不大、横断面设计、未定量病毒载量、未评估病毒对中性粒细胞的直接作用等，这些都为未来研究指明了方向。