SMN缺乏通过TRAF6介导的YBX1泛素化降解抑制软骨内成骨的机制研究

《Bone Research》：SMN deficiency inhibits endochondral ossification via promoting TRAF6-induced ubiquitination degradation of YBX1 in spinal muscular atrophy

　　本研究针对脊髓性肌萎缩症(SMA)中骨骼发育异常的机制，首次揭示了运动神经元存活蛋白(SMN)缺乏通过促进肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)介导的Y盒结合蛋白1(YBX1)泛素化降解，进而导致软骨内成骨相关基因可变剪接异常的新机制。研究人员通过单细胞RNA测序、蛋白质组学和多组学分析，发现SMN与YBX1的直接相互作用对维持生长板软骨细胞分化至关重要。该研究为理解SMA骨骼病变的细胞自主机制提供了新视角，为改善患者生活质量提供了潜在治疗靶点。

　　

在儿童遗传性神经肌肉疾病中，脊髓性肌萎缩症(SMA)以其进行性运动功能丧失为特征，但近年来研究发现，除了典型的肌肉萎缩症状，患者还普遍存在骨骼发育异常，包括骨生长缺陷、长骨骨折和脊柱侧弯等严重并发症。尽管已有针对SMN蛋白的基因治疗和药物干预手段能显著延长患者生命，但骨骼病变问题仍未得到有效解决，严重影响患者的长期生活质量。

以往研究多关注SMA的神经肌肉病变机制，而对骨骼系统的研究相对缺乏。特别值得注意的是，在SMA小鼠模型中，骨骼生长缺陷甚至早于神经肌肉症状出现，提示骨骼异常可能独立于神经退行性过程。这引发了科学家的思考：SMN蛋白缺乏是否通过细胞自主性机制直接影响骨骼发育？其中又涉及哪些关键分子事件？

为了解答这些疑问，苏州大学附属第二医院周晓忠教授团队在《Bone Research》发表了创新性研究。研究人员首先通过分析肥大软骨细胞谱系追踪模型的单细胞RNA测序数据，发现SMN1基因在软骨细胞分化过程中持续表达，特别是在表达Ptn和Palmd标记的骨骼干细胞和祖细胞群体中显著富集。这些细胞位于假时间轨迹的中间位置，负责向成骨细胞谱系分化，暗示SMN可能在软骨内成骨过程中发挥重要作用。

+细胞在E16.5(a)和2月龄(b)时的UMAP可视化。c-d 各细胞簇中Smn1表达水平的小提琴图。e 2月龄时不同tdTomato⁺细胞簇标记基因的平均表达点图。f 2月龄时所有tdTomato⁺细胞的Monocle 3轨迹分析UMAP可视化。g 2月龄时簇2标记基因的GO分析。h Smn1相关基因的GO分析。i-l SMA和Het小鼠在P0、P4和P7时的阿利新蓝-阿尔新红双染色及体长、肱骨、股骨和胫骨长度统计。m P4 Het小鼠生长板中SMN的免疫荧光染色'>

研究人员利用严重SMA小鼠模型(Smn1^-/-; SMN2^2TG/0)发现，从出生后第4天(P4)开始，SMA小鼠就表现出明显的体型矮小和长骨缩短。组织学分析显示，SMA小鼠生长板中肥大区(HZ)面积比例和高度显著增加，肥大软骨细胞体积减小、密度增高，同时肥大区钙化过度而干骺端钙化不足，表明软骨内成骨过程受阻。

机制探索方面，研究团队采用多组学方法揭示了关键分子事件。RNA测序显示SMA生长板软骨中633个基因上调和241个基因下调，主要富集在软骨细胞分化和成骨相关通路。更重要的是，研究人员发现了3177个显著的可变剪接事件，其中外显子跳跃(SE)占65.63%，且69.9%的SE事件包含度降低。这些剪接异常基因显著富集于软骨内成骨、骨发育和骨矿化等生物学过程。

通过蛋白质组学分析，研究团队鉴定出827个SMN结合蛋白，其中Y盒结合蛋白1(YBX1)作为关键的RNA剪接因子引起了特别关注。实验证实SMN与YBX1存在直接相互作用，且SMN缺失导致YBX1蛋白水平显著降低，而mRNA水平不变，提示存在转录后调控机制。进一步研究发现，SMN缺失增强了TRAF6与YBX1的相互作用，促进YBX1的泛素化降解。使用TRAF6泛素连接酶活性抑制剂C25-140能够有效恢复YBX1水平，证实了TRAF6在其中的关键作用。

为验证软骨细胞自主性机制，研究人员构建了软骨细胞特异性Smn1敲低(Smn1-cKD)小鼠模型。尽管股骨长度未受影响，但Smn1-cKD小鼠椎体和股骨的骨体积分数(BV/TV)和小梁骨厚度(Tb.Th)显著降低，表现出骨质疏松样表型。更重要的是，在SMA小鼠中软骨细胞特异性过表达Smn1(Smn1-cOE)能够部分挽救骨骼发育缺陷，恢复YBX1蛋白水平及软骨内成骨相关标志物表达。

本研究主要采用了以下关键技术方法：单细胞RNA测序分析公共数据集GSE190616和GSE179148；严重SMA小鼠模型(Smn1^-/-; SMN2^2TG/0)和软骨细胞条件性基因操作模型；生长板软骨组织RNA测序和可变剪接分析(rMATS)；蛋白质质谱分析鉴定SMN结合蛋白；免疫共沉淀验证蛋白质相互作用；体外ATDC5软骨细胞系基因敲低和过表达实验；组织学染色(HE、SF、VK)和免疫荧光分析；显微CT骨微结构评估。

SMN调控软骨内成骨进程

单细胞RNA测序分析显示，SMN1在肥大软骨细胞及其后代中广泛表达，特别是在表达Ptn和Palmd的骨骼干细胞和祖细胞(SSPCs)群体中高表达。这些细胞位于成骨谱系分化的中间阶段，其标记基因显著富集于细胞外基质组织、间充质细胞分化和成骨等生物学过程，表明SMN在肥大软骨细胞向骨分化过程中起重要调控作用。

SMN缺失阻碍出生后骨骼发育

严重SMA小鼠从P4开始出现明显的体型矮小和长骨缩短。免疫荧光显示SMN蛋白在生长板软骨中广泛表达，在肥大区信号最强。蛋白印迹证实SMA生长板软骨中SMN表达降低约50%，表明SMN对生长板介导的软骨内成骨至关重要。

SMN缺失导致生长板解剖结构异常

组织学分析发现，SMA小鼠生长板肥大区面积比例和高度显著增加，肥大软骨细胞体积减小、密度增高，同时肥大区钙化过度而干骺端钙化不足。使用ASO10-29(促进SMN2基因外显子7包含的反义寡核苷酸)恢复SMN水平后，这些异常表型得到显著改善，证实SMN缺失直接导致生长板结构缺陷。

SMN缺失抑制软骨内成骨进展

RNA测序显示SMA生长板软骨中软骨发育相关基因(Matn1、Col2a1、Acan)、软骨分化相关基因(Sox9、Tgfb1、Col10a1、Runx2、Wnt10b、Ihh)和成骨相关基因(Alpl、Sp7、Col1a1)显著下调。免疫荧光证实SOX9、RUNX2、COL X和SP7蛋白表达降低，表明SMN缺失抑制肥大软骨细胞分化和成熟进程。

SMN缺失扰乱软骨内成骨相关基因的可变剪接

可变剪接分析发现SMA软骨中存在3177个显著剪接事件，主要影响外显子跳跃(SE)和内含子保留(RI)。这些剪接异常基因显著富集于软骨内成骨相关通路，其中Idau、P2rx7、Vegfa和Fgfr3等基因的剪接异常经实验验证，且ASO10-29处理可纠正这些异常剪接事件。

SMN缺失导致YBX1减少

蛋白质质谱鉴定YBX1为关键SMN结合蛋白，实验证实SMN与YBX1存在直接相互作用。SMN缺失导致YBX1蛋白水平降低而不影响其mRNA表达，且蛋白酶体抑制剂MG132可阻断YBX1降解，表明SMN通过调控YBX1稳定性发挥作用。

SMN缺失促进TRAF6诱导的YBX1泛素化降解

机制研究表明，SMN缺失增强TRAF6与YBX1的相互作用，促进YBX1泛素化降解。SMN过表达或TRAF6抑制剂处理可恢复YBX1水平，证实SMN-TRAF6-YBX1轴在调控YBX1稳定性中的核心作用。

软骨细胞SMN缺失导致骨骼发育迟缓

软骨细胞特异性Smn1敲低小鼠表现为骨量减少和骨小梁厚度降低，生长板肥大区扩张，软骨内成骨相关蛋白表达下降，证实SMN在软骨细胞中的细胞自主性作用对骨骼发育至关重要。

软骨细胞特异性SMN恢复部分逆转SMA小鼠的软骨内成骨缺陷

在SMA小鼠中软骨细胞特异性过表达Smn1可部分挽救体重、股骨长度、骨微结构异常和生长板缺陷，恢复YBX1及成骨相关蛋白表达，表明靶向软骨细胞SMN表达可能成为改善SMA骨骼病变的潜在策略。

本研究系统阐明了SMN缺失通过TRAF6-YBX1轴调控软骨内成骨的新机制。SMN缺乏促进TRAF6介导的YBX1泛素化降解，导致软骨内成骨相关基因表达和剪接异常，最终引起骨骼发育缺陷。这一发现不仅深化了对SMA骨骼病变机制的理解，也为开发针对骨骼并发症的治疗策略提供了新靶点。研究首次将SMN的生物学功能与YBX1稳定性调控联系起来，揭示了RNA剪接与蛋白质降解途径在骨骼发育中的交叉对话，为相关遗传性骨骼疾病的机制研究提供了新视角。