脂肪源干细胞外泌体miR-212-5p通过靶向FOXO1激活PP1A/YAP1信号通路促进肌腱修复

《Communications Biology》：Exosomal miR-212-5p promotes tendon repair via targeting FOXO1 to activate PP1A/YAP1 signaling

　　肌腱损伤修复是临床难题。本研究揭示了脂肪源干细胞外泌体（ADSC-Exos）通过递送miR-212-5p调控肌腱源性干细胞（TDSCs）功能的新机制。研究人员发现miR-212-5p直接靶向抑制FOXO1，解除其对PP1A的转录抑制，进而促进YAP1去磷酸化激活，最终增强TDSCs的增殖、迁移和成腱分化能力，显著促进小鼠肌腱损伤修复。该研究为肌腱再生治疗提供了新的靶点和策略。

　　

肌腱是连接肌肉和骨骼的重要结缔组织，在日常活动和运动中容易因重复劳损或急性创伤而受伤。肌腱损伤会导致疼痛、活动受限，严重影响生活质量。据统计，全球每年有超过3000万例肌腱损伤病例，且发病率持续上升。然而，由于肌腱组织固有的再生能力有限，其愈合过程通常缓慢且不完全，常导致功能恢复不佳。目前的治疗方法，如物理治疗、药物和手术，往往难以实现完全的功能性恢复和防止再损伤。因此，开发更有效的肌腱再生策略成为骨科和运动医学领域的重要挑战。

近年来，干细胞疗法为组织再生带来了希望。其中，脂肪源干细胞（ADSCs）因其来源丰富、获取便捷、免疫原性低等优势而备受关注。ADSCs分泌的外泌体（ADSC-Exos）作为细胞间通讯的关键媒介，携带蛋白质、脂质、信使RNA（mRNA）和微RNA（miRNA）等多种生物活性分子，能够被受体细胞摄取，从而调控其生物学行为。已有研究表明，ADSC-Exos可以促进肌腱源性干细胞（TDSCs）的增殖、迁移和成腱分化，但其具体的作用分子机制尚不完全清楚。特别是外泌体中所携带的特定miRNA如何精确调控肌腱修复过程，仍有待深入探索。为了解决这些问题，林克锋、胡旭、严瑾等研究人员在《Communications Biology》上发表了一项研究，揭示了ADSC-Exos中的miR-212-5p通过调控FOXO1/PP1A/YAP1信号轴促进肌腱修复的新机制。

本研究运用了一系列关键技术方法。研究人员从小鼠体内分离并鉴定了ADSCs和TDSCs，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹法对分离出的ADSC-Exos进行了表征。功能实验方面，采用了MTT法、EdU染色、细胞划痕实验和Transwell实验分别评估TDSCs的活力、增殖和迁移能力。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹法检测成腱分化标志物（TNC, TNMD, Scx, COL1A1）的表达。机制探讨中，应用了双荧光素酶报告基因实验、RNA Pull-down实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）实验和免疫荧光染色等技术验证分子间的相互作用及信号通路。最后，通过构建小鼠跟腱损伤模型，进行组织学染色、免疫组化、生物力学测试等体内实验，验证ADSC-Exos及其携带的miR-212-5p的治疗效果。

研究结果

外泌体表征与摄取

研究人员首先成功从ADSCs的培养上清液中分离出外泌体。透射电镜显示其呈典型的杯状形态，纳米颗粒追踪分析表明其粒径主要分布在100纳米左右，蛋白质印迹检测到外泌体标志蛋白CD9、TSG101和HSP70高表达，而阴性标志物Calnexin不表达。用PKH-67荧光染料标记ADSC-Exos后与TDSCs共培养，证实ADSC-Exos能够被TDSCs有效内化。

ADSC-Exos促进TDSCs功能

功能实验表明，用不同浓度（0-80 μg/mL）的ADSC-Exos处理TDSCs后，其细胞活力、增殖能力（MTT和EdU实验）以及迁移能力（划痕实验和Transwell实验）均呈剂量依赖性增强。同时，成腱分化标志物（TNC、TNMD、Scx和COL1A1）的mRNA和蛋白表达水平也显著上调。值得注意的是，ADSC-Exos处理抑制了TDSCs的软骨源性分化（阿利新蓝染色减弱），但对成骨、成脂分化及血管生成相关基因表达影响不显著。

miR-212-5p是ADSC-Exos发挥作用的关键分子

ADSC-Exos处理能剂量依赖性地提高TDSCs内miR-212-5p的水平。当在ADSCs中敲低miR-212-5p后，其来源的外泌体（Exo-miR-212-5p inhibitor）促进TDSCs增殖、迁移和成腱分化的能力被显著削弱。直接在TDSCs中抑制miR-212-5p也能逆转ADSC-Exos的上述促进作用。这些结果证明miR-212-5p是ADSC-Exos调控TDSCs功能的核心效应分子。

miR-212-5p靶向抑制FOXO1激活YAP1信号

生物信息学分析预测FOXO1是miR-212-5p的潜在靶标。双荧光素酶报告基因实验和RNA Pull-down实验证实miR-212-5p可直接结合FOXO1 mRNA的3'非翻译区（3'UTR）并抑制其表达。在TDSCs中，用敲低了miR-212-5p的ADSC-Exos（即Exo-miR-212-5p inhibitor）处理，会导致FOXO1蛋白水平升高，同时Yes相关蛋白1（YAP1）在丝氨酸127位点的磷酸化水平（p-YAP1^Ser127）增加，而总YAP1蛋白水平变化不大。YAP1磷酸化会使其滞留在胞质中失活，抑制其促增殖转录功能。当在TDSCs中同时敲低FOXO1时，可以逆转因外泌体miR-212-5p敲低所引起的YAP1磷酸化水平升高。这表明ADSC-Exos来源的miR-212-5p是通过抑制FOXO1来激活YAP1信号的。

FOXO1转录抑制PP1A表达

通过JASPAR数据库预测和ChIP实验验证，发现FOXO1可以直接结合到蛋白磷酸酶1A（PP1A）的启动子区域。FOXO1过表达会抑制PP1A的转录活性，而敲低FOXO1则促进PP1A表达。已知PP1A可以使YAP1去磷酸化从而激活其功能。实验进一步显示，敲低FOXO1可导致p-YAP1^Ser127水平下降，核内YAP1增多；若同时敲低PP1A，则能部分逆转FOXO1敲低引起的YAP1去磷酸化。这明确了FOXO1通过抑制PP1A转录，进而促进YAP1磷酸化并抑制其活性的分子通路。

功能挽救实验验证信号轴

一系列功能挽救实验证实了该信号轴的生物学功能。在TDSCs中，敲低外泌体miR-212-5p所导致的增殖、迁移和成腱分化能力下降，可以通过同时敲低TDSCs中的FOXO1来挽救。同样，FOXO1过表达对TDSCs功能的抑制作用，可以通过共表达一个磷酸化位点突变（YAP1-S127A，模拟持续激活状态）的YAP1来逆转。这表明FOXO1确实是通过促进YAP1磷酸化来抑制TDSC功能的。

体内实验验证治疗作用

在小鼠跟腱损伤模型中，局部注射ADSC-Exos能显著促进肌腱修复，表现为胶原纤维排列更有序，软骨样基质沉积（番红O固绿染色）减少，成腱标志物（TNMD, Scx, COL1A1）表达上调，软骨标志物SOX9表达下调，肌腱的失效负荷和刚度等生物力学性能也得到改善。然而，注射敲低了miR-212-5p的ADSC-Exos则无此治疗效果。分子水平上，ADSC-Exos治疗组的肌腱组织中FOXO1和p-YAP1^Ser127水平下降，而PP1A水平升高，再次验证了FOXO1/PP1A/YAP1信号轴在体内的活化。

结论与讨论

本研究系统地阐明了ADSC-Exos通过携带的miR-212-5p促进肌腱修复的新机制：外泌体miR-212-5p被TDSCs摄取后，直接靶向抑制FOXO1的表达；FOXO1的下调解除其对PP1A基因的转录抑制，使PP1A表达增加；增加的PP1A进而使YAP1去磷酸化，激活的YAP1进入细胞核，启动下游基因转录，最终促进TDSCs的增殖、迁移和成腱分化，加速肌腱组织修复。

该研究的创新性在于首次揭示了ADSC-Exos-miR-212-5p/FOXO1/PP1A/YAP1这一完整的信号调控轴在肌腱修复中的关键作用。它不仅深化了我们对干细胞外泌体作用机制的理解，也为肌腱损伤的临床治疗提供了新的潜在靶点——即靶向miR-212-5p或调控其下游信号通路。基于外泌体的疗法具有低免疫原性、高稳定性、易于储存和运输等优势，展现出良好的临床转化前景。当然，研究者也指出，本研究采用的急性肌腱损伤模型尚不能完全模拟临床常见的因过度使用导致的慢性肌腱病的复杂病理过程，未来需要在更慢性或修复整合的模型中进行验证，并开展更长期的疗效和安全性评估，以推动该策略最终走向临床应用。