Cilk1通过Hedgehog信号梯度依赖性调控牙齿模式形成的新机制

《International Journal of Oral Science》：Progressive tooth pattern changes in Cilk1-deficient mice depending on Hedgehog signaling

　　本研究针对Cilk1在牙齿发育中的作用机制这一空白，通过构建Cilk1基因缺陷小鼠模型，结合组织特异性敲除、肾脏被膜下移植、RNA测序等技术，首次揭示了Cilk1缺失通过破坏初级纤毛动力学，下调Hedgehog(Hh)信号通路活性（Ptch1、Sostdc1等靶基因表达降低），导致小鼠臼齿区间隙性多生牙（R2）形成。尤为重要的是，在Cilk1-/-;PCS1-MRCS1△/△双突变小鼠中，观察到R2可大于第一臼齿（M1）乃至发生臼齿融合，由此提出了Hh信号水平梯度性降低依次诱发R2保留、R2增大和臼齿融合的渐进式牙齿模式调控模型，深化了对纤毛-Hh信号轴在颅颌面发育中作用的理解。

　　

在哺乳动物的口腔中，牙齿的精确排列是保证其正常咀嚼功能的基础。然而，牙齿发育是一个极其复杂的生物学过程，受到多种信号通路的精密调控。其中，Hedgehog（Hh）信号通路在器官模式形成和形态发生中扮演着关键角色。初级纤毛作为一种突出于细胞表面的天线状结构，是Hh信号通路的核心转导中心。已有研究表明，Hh信号通路的紊乱与小鼠模型中多生牙的形成和臼齿融合等牙齿模式异常密切相关。Cilk1（Ciliogenesis-associated kinase 1，纤毛发生相关激酶1）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，定位于初级纤毛内部，在纤毛内运输（IFT）和信号转导中发挥关键作用。Cilk1的功能缺失会导致严重的纤毛病表型，如多指（趾）畸形、水肿和腭裂。然而，Cilk1在牙齿发育中的具体功能，尤其是在调控牙齿模式形成中的作用，此前仍属未知。

为了解决这一科学问题，由韩国延世大学齿科学院口腔生物学系Cho Sung-Won教授和全北大学齿科学院口腔生物科学研究所Cho Eui-Sic教授等领导的研究团队，在《International Journal of Oral Science》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在系统阐明Cilk1在牙齿发育过程中的表达模式、功能及其分子机制，特别是其如何通过调控Hh信号通路来影响牙齿的数目、大小和排列模式。

研究人员综合运用了多种关键技术方法来开展此项研究。这包括利用基因工程手段构建了全身性Cilk1敲除（Cilk1^-/-）、上皮特异性敲除（Krt14-Cre;Cilk1^fl/fl）、间充质特异性敲除（Wnt1-Cre;Cilk1^fl/fl）以及Hh信号双重抑制的复合突变小鼠（Cilk1^-/-;PCS1-MRCS1^△/△）模型。通过对这些模型小鼠的牙齿表型进行组织学分析、显微计算机断层扫描（micro-CT）三维重建，并结合RNA测序（RNA-seq）、定量PCR（qPCR）、RNA原位杂交进行分子表达谱分析，以及利用免疫荧光染色观察初级纤毛的形态和分布。此外，还通过肾脏被膜下移植实验评估了Cilk1缺陷型牙胚形成钙化牙齿的能力。

Cilk1缺失导致间隙性多生牙形成

研究首先发现Cilk1在发育中的磨牙上皮和间充质中均有表达。Cilk1全身性敲除（Cilk1^-/-）小鼠在胚胎期14.5天（E14.5）和E16.5均出现了位于第一臼齿（M1）近中的间隙性多生牙（R2）。在出生当天（PN 0）， micro-CT确认R2在Cilk1^-/-小鼠的上颌和下颌均持续存在，且其尺寸小于M1。这些小鼠还伴有腭裂和舌分叶等颅面畸形。

Cilk1缺失增加初级纤毛长度并降低Hh信号活性

对E15.5磨牙的免疫荧光分析显示，与野生型相比，Cilk1^-/-小鼠牙胚中初级纤毛显著伸长，但具有纤毛的细胞比例明显下降。RNA测序和qPCR分析进一步表明，Cilk1^-/-小鼠牙胚中Hh信号通路的关键靶基因，如Ptch1、Gli1、Sostdc1、Hhip和Foxf2的表达水平显著下调。

间充质Cilk1对牙齿模式至关重要

通过组织特异性敲除小鼠模型，研究发现上皮特异性敲除Cilk1（Krt14-Cre;Cilk1^fl/fl）不影响牙齿模式，而由颅神经嵴来源的间充质特异性敲除Cilk1（Wnt1-Cre;Cilk1^fl/fl）则能重现全身性敲除小鼠的R2表型。这表明间充质中的Cilk1及其相关的初级纤毛功能在牙齿模式调控中起主导作用。

Cilk1缺陷牙胚可形成钙化牙齿

为了研究Cilk1在牙齿发育后期的作用（因Cilk1^-/-小鼠围产期致死），研究人员将E14.5的Cilk1^-/-小鼠下颌磨牙牙胚移植到野生型成年小鼠的肾脏被膜下。移植4周后，Cilk1^-/-牙胚成功形成了完全钙化的牙齿，其模式与胚胎期观察一致，即最左侧的牙齿（R2）小于中央的牙齿（M1）。组织学分析显示Cilk1^-/-牙齿具有釉质、牙本质、牙本质小管、前期牙本质和成牙本质细胞，但牙根长度短于野生型。上皮特异性敲除小鼠（Krt14-Cre;Cilk1^fl/fl）在出生后能正常形成矿化的釉质和牙本质，表明Cilk1对于成釉细胞和成牙本质细胞的分化及硬组织形成并非必需。

牙齿模式依赖于Hh通路活性

为了进一步探究Hh信号活性水平对牙齿模式的影响，研究人员构建了Cilk1^-/-;PCS1-MRCS1^△/△双突变小鼠。PCS1-MRCS1^△/△小鼠由于缺失口腔特异性Shh增强子，其Shh表达降低。在该复合突变体中，Hh信号在Shh产生细胞和Shh响应细胞中同时受到抑制。表型分析发现，与单纯的Cilk1^-/-或PCS1-MRCS1^△/△小鼠相比，双突变小鼠的牙齿表型更为严重：除了R2形成外，在上颌还观察到了M1和M2的融合。RNA测序和基因表达分析证实，Hh靶基因的表达在Cilk1^-/-小鼠中下调，并在Cilk1^-/-;PCS1-MRCS1^△/△小鼠中进一步降低，呈现渐进性抑制。

定量分析显示，随着Hh信号活性的降低（从野生型到Wnt1-Cre;Cilk1^fl/fl，再到Cilk1^-/-，最后到Cilk1^-/-;PCS1-MRCS1^△/△），R2形成的发生率增加。更重要的是，R2相对于M1的大小（R2/M1比率）也显著且渐进性地增加。在Cilk1^-/-;PCS1-MRCS1^△/△小鼠的下颌，R2/M1比率范围为0.90至1.16，意味着R2大小可与M1相当甚至更大；在其上颌，该比率变化范围更广（0.90至2.61），部分个体的R2尺寸远超M1，并与融合臼齿的大小相近。

本研究首次揭示了Cilk1通过调控初级纤毛功能和Hh信号通路活性在牙齿模式形成中的关键作用。研究发现Cilk1缺失导致纤毛动力学异常（纤毛伸长、有纤毛细胞比例下降）和Hh信号活性降低，进而引发间隙性多生牙（R2）的保留。通过构建Hh信号活性梯度下降的小鼠模型（Cilk1^-/- -> Cilk1^-/-;PCS1-MRCS1^△/△），研究取得了突破性发现：随着Hh信号抑制程度的加深，牙齿模式异常呈现渐进式变化，即从R2形成，到R2尺寸增大（甚至大于M1），最终导致臼齿融合。

基于这些发现，研究人员提出了一个创新的渐进式模型来解释Hh信号水平梯度性调控牙齿模式的机制。在正常发育中，瞬态牙胚R2通常会退化。当Hh信号轻度抑制时，R2得以保留但尺寸较小。随着Hh信号进一步减弱，发育中的R2和M1之间的相互抑制作用降低，使得R2能够扩大。当Hh通路被严重抑制时，相邻臼齿间的界限变得模糊，最终导致融合。该模型为理解多种信号通路突变导致牙齿模式多样性的现象提供了统一框架。

这项研究不仅填补了Cilk1在牙齿发育中功能的认知空白，而且揭示了Hh信号梯度在塑造器官模式中的精细调控作用，对理解相关纤毛病及牙齿发育异常的病因机制具有重要理论意义。