基于血清miRNA的子宫内膜异位症分子诊断：从NGS发现到qPCR临床转化的可行性研究

《npj Women's Health》：Translation of miRNA blood-based discovery to molecular testing for clinical diagnosis of endometriosis

　　本研究针对子宫内膜异位症诊断延迟长达6-11年的临床困境，开发了一种基于血清miRNA的非侵入性诊断方法。研究人员通过miRNA测序发现85个差异表达miRNA，机器学习模型AUC达0.98。实验验证确认miR-21-5p和miR-15b-5p的诊断价值，并首次建立疾病特异性内参miR-92a-3p。该研究为替代创伤性腹腔镜手术提供了重要技术路径，推动精准医疗在妇科疾病领域的应用。

　　

对于全球约10%的育龄女性而言，子宫内膜异位症犹如一个"隐形杀手"，其诊断平均需要耗费6-11年时间。这种常见的妇科疾病不仅导致慢性盆腔疼痛、不孕等严重症状，更因缺乏可靠的诊断方法而长期困扰着临床医生和患者。目前，腹腔镜检查作为诊断金标准，不仅具有创伤性，其准确性还高度依赖手术医生的经验，在某些研究中灵敏度甚至低于70%。

在这种临床困境下，来自HerAnova Lifesciences和浙江大学医学院附属妇产科医院的研究团队另辟蹊径，将目光投向了血液中微小的分子信使——microRNA（miRNA）。这些长度约22个核苷酸的非编码RNA分子，在调控基因表达中扮演着关键角色，且能在血液中稳定存在，成为理想的生物标志物候选者。该团队在《npj Women's Health》发表的最新研究，系统探索了将高通量测序技术发现的miRNA标志物转化为临床可用诊断方法的可行性。

研究团队首先精心设计了样本采集方案，所有血液样本均来自分泌期女性，并通过孕酮水平检测进行验证，最大限度减少月经周期对miRNA表达的干扰。在发现队列中，20例子宫内膜异位症患者和20例对照者的血清样本经过miRNA测序（miRNA-seq）分析，揭示了85个差异表达的miRNA分子，其中55个上调，30个下调。

有趣的是，这些差异miRNA主要来源于骨髓和宫颈组织，后者与子宫内膜异位症病灶的解剖位置相邻，增强了这些分子标志物的生物学合理性。通路富集分析显示，这些miRNA参与的焦点粘连和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路与子宫内膜异位症的发病机制密切相关。

研究人员构建的机器学习模型展现了出色的诊断性能。使用全部85个差异miRNA的模型灵敏度达0.91，特异性0.88，AUC（受试者工作特征曲线下面积）为0.95。而经过特征选择后，仅使用前20个最重要miRNA的模型性能进一步提升，AUC高达0.98，灵敏度0.95，特异性0.90。

然而，将NGS发现转化为临床适用的诊断方法面临重大挑战。研究人员发现，在85个差异miRNA中，有38个因表达量过低（平均标准化读数<500）无法通过qPCR（实时定量聚合酶链反应）可靠检测。这一发现凸显了技术平台转换过程中的敏感性差异问题。

另一个关键突破是内参基因的选择。与传统使用GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）或miR-16等"通用"内参不同，本研究通过生物信息学分析鉴定了疾病特异性内参miR-92a-3p，该分子在患者和对照群体中表达稳定，为qPCR数据的可靠标准化奠定了基础。

在实验验证阶段，研究人员选择了5个候选miRNA（miR-21-5p、miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19b-3p和miR-23a-3p）在扩大样本（65例患者、25例对照）中进行qPCR验证。结果显示，miR-21-5p和miR-15b-5p的表达差异与NGS发现一致，具有统计学意义；miR-17-5p显示出趋势但未达显著性；而另外两个miRNA则未能在独立样本中验证其诊断价值。

技术方法方面，研究采用前瞻性收集的血清样本，通过miRNA-seq进行差异表达分析，利用随机森林算法构建诊断模型，并采用qPCR进行实验验证，同时建立了疾病特异性内参选择标准。

差异表达的miRNA在子宫内膜异位症患者中的特征

研究发现分泌期样本中存在85个差异表达miRNA，其中55个上调、30个下调，呈现明显的疾病相关分子特征。miR-9-5p和miR-21-5p等已知与炎症信号通路调控相关的miRNA显著失调。组织来源分析显示这些miRNA主要源自骨髓和宫颈，后者与子宫内膜异位症病灶的解剖位置相邻。通路富集分析揭示了焦点粘连和MAPK信号通路等与疾病病理生理学相关的关键过程。

基于机器学习模型的诊断性能评估

研究人员构建了三个随机森林模型进行评估。使用全部85个miRNA的模型灵敏度为0.91，特异性0.88，AUC 0.95。精选前40个miRNA的模型性能提升至AUC 0.97，而前20个miRNA的模型表现最优，AUC达0.98，灵敏度0.95，特异性0.90。这表明特征选择不仅能提高模型性能，还能增强临床转化的可行性。

适用于非NGS临床诊断的miRNA生物标志物和内参选择

研究确定了qPCR可靠检测的表达式阈值为500标准化读数，47个miRNA符合要求。使用这些miRNA构建的模型AUC为0.78-0.84，经miR-92a-3p标准化后性能提升至AUC 0.80-0.88。这一发现强调了适当内参选择对qPCR诊断的重要性。

诊断性qPCR检测的实验评估

在90例样本中验证5个候选miRNA，结果显示miR-21-5p和miR-15b-5p的表达差异具有统计学意义，与NGS发现一致。miR-17-5p呈现趋势但未达显著性，而miR-19b-3p和miR-23a-3p未显示显著差异。这表明部分NGS发现的标志物能在qPCR平台重现，但需要进一步优化。

该研究的重要意义在于系统探索了子宫内膜异位症分子诊断从生物标志物发现到临床转化的完整路径。不仅鉴定了具有诊断价值的血清miRNA标志物，还解决了技术转化中的关键瓶颈——内参标准化问题。尽管qPCR验证仅部分重现了NGS发现，但研究为开发非侵入性诊断方法提供了重要理论基础和实践指南。

未来研究需要通过引物优化、采用ddPCR（微滴式数字PCR）提高检测灵敏度、扩大样本量等策略进一步完善检测体系。随着标准化程度的提高和技术成本的降低，基于血清miRNA的子宫内膜异位症诊断有望成为腹腔镜检查的可靠替代方案，显著改善患者的诊疗体验和预后。