环状RNA circKNSTRN通过调控miR-320a-3p/SPAG5轴促进乳腺癌进展的机制研究

《Scientific Reports》：The circRNA circKNSTRN promotes breast cancer progression by modulating the miR-320a-3p/SPAG5 axis

　　本研究针对乳腺癌治疗靶点匮乏的临床难题，聚焦环状RNA circKNSTRN在乳腺癌中的调控机制。通过体内外实验证实circKNSTRN可通过吸附miR-320a-3p上调SPAG5表达，进而促进乳腺癌细胞增殖、迁移并调控细胞周期。该研究首次揭示circKNSTRN/miR-320a-3p/SPAG5轴在乳腺癌进展中的关键作用，为乳腺癌诊断和治疗提供了新的潜在靶点。

　　

乳腺癌作为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，其治疗面临巨大挑战。尽管手术、化疗、内分泌治疗等手段不断进步，但患者预后仍不理想，特别是中国女性发病年龄早、肿瘤分期晚的特点更增加了治疗难度。研究表明，精子相关抗原5（SPAG5）在乳腺癌中高表达且与不良预后相关，但其上游调控机制尚不明确。南京医科大学附属常州第二人民医院团队在《Scientific Reports》发表的研究，首次揭示了环状RNA circKNSTRN通过miR-320a-3p/SPAG5轴促进乳腺癌进展的新机制。

研究人员首先通过生物信息学分析发现circKNSTRN（hsa_circ_0103433）可能参与SPAG5的调控。通过桑格测序、RT-PCR和RNase R消化实验证实了circKNSTRN的环状结构特征，荧光原位杂交显示其主要定位于细胞质。在35对临床样本中发现circKNSTRN在癌组织中显著高表达，且与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，乳腺癌细胞系MCF-7和T47D中表达明显上调。

关键技术方法包括：利用35例临床样本进行表达验证；通过慢病毒载体构建circKNSTRN敲低和过表达细胞模型；采用EdU染色、克隆形成、Transwell和小鼠移植瘤实验评估细胞功能；通过双荧光素酶报告基因、RNA pull-down和FISH实验验证分子相互作用；使用流式细胞术分析细胞凋亡和周期。

CircKNSTRN在乳腺癌细胞中的验证和分析

研究人员通过设计特异性引物证实circKNSTRN来源于KNSTRN基因5-8号外环的反向剪接，其环状结构对RNase R具有抗性，半衰期显著长于线性KNSTRN。亚细胞定位显示circKNSTRN主要分布于细胞质，这为其作为竞争性内源RNA（ceRNA）的功能奠定了基础。

CircKNSTRN促进乳腺癌细胞增殖

临床样本检测显示circKNSTRN在癌组织中表达显著升高。功能实验表明，敲低circKNSTRN可抑制细胞增殖，而过表达则促进增殖。动物实验进一步证实，circKNSTRN过表达组移植瘤体积和重量显著增加，Ki-67染色阳性率升高，而敲低组呈现相反趋势。

CircKNSTRN促进乳腺癌细胞迁移

Transwell和划痕实验显示，circKNSTRN敲低显著抑制细胞迁移能力，而过表达则增强迁移。这表明circKNSTRN在乳腺癌侵袭转移过程中发挥重要作用。

CircKNSTRN调控细胞凋亡和周期

流式细胞术检测发现，敲低circKNSTRN可诱导细胞凋亡，并使细胞阻滞在G1期；而过表达则减少凋亡，促进G1/S期转换。这表明circKNSTRN通过调控细胞周期进程影响肿瘤生长。

CircKNSTRN作为miR-320a-3p海绵

通过数据库预测和实验验证，发现circKNSTRN与miR-320a-3p存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实两者直接结合，RNA pull-down和FISH实验显示它们在细胞质中共定位。表达分析显示miR-320a-3p在癌组织中低表达，且与circKNSTRN呈负相关。

MiR-320a-3p逆转circKNSTRN的功能效应

挽救实验表明，miR-320a-3p模拟物可逆转circKNSTRN过表达促增殖和迁移作用，而抑制剂则可缓解敲低效应。这证实了circKNSTRN通过吸附miR-320a-3p发挥生物学功能。

CircKNSTRN/miR-320a-3p/SPAG5轴促进乳腺癌进展

Western blot和RT-qPCR显示circKNSTRN可正向调控SPAG5表达，而双荧光素酶报告基因实验证实miR-320a-3p可直接靶向SPAG5的编码区。这完整揭示了circKNSTRN/miR-320a-3p/SPAG5调控轴的存在。

该研究首次系统阐明了circKNSTRN在乳腺癌中的致癌作用及其分子机制。circKNSTRN通过ceRNA机制吸附miR-320a-3p，解除其对SPAG5的抑制作用，最终促进肿瘤进展。这一发现不仅深化了对环状RNA功能的认识，也为乳腺癌诊断提供了新的潜在生物标志物，为开发以circKNSTRN/miR-320a-3p/SPAG5轴为靶点的治疗策略奠定了理论基础。尽管研究在临床样本数量和机制深度方面存在局限，但为后续转化研究指明了方向。