线粒体自噬相关分子亚型鉴定与生物标志物NUP93在脓毒症中的多组学整合研究

《Scientific Reports》：Integrated multi-omics of mitophagy-related molecular subtype characterization and biomarker identification in sepsis

　　本研究针对脓毒症高死亡率与异质性难题，通过整合多组学数据与机器学习算法，系统鉴定出RPL18、PRPF8、NUP93和CUL1四个线粒体自噬相关基因（MAG）作为诊断标志物（AUC达0.990），并首次通过体外实验证实NUP93通过调控PINK1/LC3B通路逆转脓毒症中线粒体自噬功能障碍，为脓毒症精准分型及靶向治疗提供新策略。

　　

在重症医学领域，脓毒症始终是笼罩在患者和医生头顶的阴云。这种由感染引发宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，以其高死亡率和显著的异质性让临床治疗陷入困境。尽管早期抗生素使用、液体复苏等标准治疗方案已被广泛应用，但由于患者个体间巨大的病理生理差异，治疗效果往往不尽如人意。这种异质性不仅导致治疗反应千差万别，更使得死亡率居高不下，迫切需要精准医疗策略的出现。而有效的风险分层，能够早期识别高死亡率亚组，指导靶向治疗，为基于生物标志物的临床试验铺平道路。在这一背景下，多组学数据的整合展现出改善脓毒症预后的巨大潜力。

线粒体自噬——这种选择性清除受损线粒体的细胞自我净化机制，近年来在脓毒症研究领域崭露头角。作为自噬的特殊形式，它通过维持线粒体质量与功能，在应激状态下守护细胞稳态。在脓毒症进程中，功能失调的线粒体堆积会破坏钙稳态，增加活性氧（ROS）产生，从而加剧临床病程。而通过修复异常线粒体，线粒体自噬有助于脓毒症器官功能的恢复，在氧化应激、炎症和纤维化等脓毒症相关病理过程中都发挥着关键作用。然而，针对线粒体自噬相关基因（MAG）在脓毒症分型、诊断和免疫调节中系统性的研究仍属空白。

发表于《Scientific Reports》的这项研究，通过整合批量转录组学、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和机器学习，首次系统性地鉴定并验证了脓毒症中关键的MAG生物标志物，揭示了其分型价值，并通过功能实验证实了关键基因NUP93的调控机制。

研究团队主要运用了多组学整合分析策略：从GEO数据库获取三个脓毒症转录组数据集（GSE65682、GSE95233、GSE54514），通过“sva”R包进行批次校正；利用WGCNA构建基因共表达网络，结合差异表达分析筛选关键模块；整合10种机器学习算法的113种组合（如随机森林、XGBoost等），通过留一交叉验证（LOOCV）筛选诊断标志物；对脓毒症患者单细胞数据集GSE167363进行细胞亚群注释；通过共识聚类进行分子分型，并利用ESTIMATE和ssGSEA分析免疫浸润；最后在LPS刺激的RAW264.7细胞中通过腺病毒过表达验证NUP93功能，采用蛋白质印迹和亚细胞分级分析线粒体自噬相关蛋白。

批量效应校正与差异基因表达分析

研究整合GSE65682和GSE95233数据集，包含64例健康对照（HC）和862例脓毒症（SP）样本。PCA图显示批次校正后数据分布得到有效改善。通过差异表达分析发现SP组中淀粉蔗糖代谢、补体凝血级联等代谢炎症通路显著富集，而HC组T细胞受体信号通路、原发性免疫缺陷等免疫相关通路明显上调。

WGCNA模型构建与关键线粒体自噬相关基因鉴定

WGCNA分析确定软阈值功率β=7，识别出11个基因模块。棕色模块与HC呈正相关（r=0.44），红色模块与SP呈正相关（r=0.37），其中棕色模块显著性最高。通过差异表达基因（DEG）、关键模块基因和线粒体自噬基因集交叉筛选，最终获得9个差异表达MAG（DE-MAG），功能富集显示其参与RNA代谢、应激反应等生物过程。

基于集成机器学习算法的MAG相关生物标志物鉴定与诊断评估

通过113种机器学习算法组合评估，RF+XGBoost模型表现最优（AUC最高），筛选出RPL18、PRPF8、NUP93和CUL1四个关键MAG标志物。这些基因在SP样本中显著下调，ROC曲线显示单个基因AUC值在0.957-0.975之间。构建的列线图模型在训练集和验证集均表现出色（AUC=0.990），DCA和校准曲线验证了模型的临床实用性。

单细胞RNA测序揭示脓毒症细胞亚群

基于GSE167363数据集，从5例SP样本中鉴定出22个细胞亚群，进一步精确定义为B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞等7种主要免疫细胞。UMAP和t-SNE可视化显示四个MAG标志物广泛表达于多种免疫细胞，其中RPL18分布最广，PRPF8、NUP93和CUL1主要富集于单核细胞。

脓毒症免疫浸润景观

ESTIMATE算法显示SP组免疫评分显著低于HC组，表明脓毒症存在免疫抑制状态。ssGSEA分析发现SP组活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞等浸润减少，而活化树突状细胞、肥大细胞等增加。相关性分析显示MAG标志物与免疫细胞浸润显著相关，如RPL18与滤泡辅助T细胞、CD56^bright NK细胞呈正相关。

脓毒症中MAG相关分子亚型的鉴定

基于四个MAG标志物表达谱的共识聚类将脓毒症患者分为两个分子亚型（A和B）。PCA显示两亚型存在明显转录差异，亚型B中四个MAG标志物表达均显著上调。亚型B免疫评分更高，活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞等浸润增加，而活化树突状细胞、NK细胞等减少。GO和KEGG富集分析显示差异基因主要参与免疫活化、T细胞分化等通路。

NUP93过表达在体外炎症模型中促进线粒体自噬

在LPS刺激的RAW264.7细胞中，NUP93表达显著降低。腺病毒过表达NUP93后，线粒体LC3B水平得到恢复，表明线粒体自噬活性增强。同时，NUP93过表达逆转了LPS引起的PINK1线粒体定位障碍，恢复其在线粒体中的表达。这些结果证明NUP93通过调控PINK1定位和表达促进脓毒症中的线粒体自噬。

研究结论与讨论部分强调，该研究不仅证实了MAG在脓毒症分层中的潜力，还通过体外实验验证了关键MAG——NUP93在炎症模型中对线粒体自噬的调控作用。线粒体自噬在脓毒症相关并发症进展中扮演重要角色，如肾小管上皮细胞线粒体损伤是脓毒症急性肾损伤（AKI）的关键因素，而线粒体自噬可通过改善线粒体质量减轻AKI严重程度。通路富集分析显示差异MAG与T细胞活化相关，大量证据表明线粒体自噬与T细胞存在联系：线粒体功能障碍（包括线粒体自噬受损）是T细胞衰老的标志，减少的线粒体自噬活性会导致去极化线粒体在T细胞中积累并加剧T细胞耗竭。

尽管目前尚无直接证据表明NUP93与脓毒症相关，但其在肾脏和心脏疾病中的明确作用提示，对NUP93的进一步研究可能为患者分层提供宝贵见解。同时，筛选出的其他关键MAG也各具重要意义：RPL18可能通过影响JAK2-STAT3信号通路在脓毒症进程中影响线粒体功能；CUL1作为支架蛋白是泛素-蛋白酶体系统的核心组分，在脓毒症中可能通过p27蛋白调控线粒体自噬；PRPF8作为缺氧诱导线粒体自噬的关键介质，可能在脓毒症相关的微循环改变和代谢重编程中发挥作用。

研究的局限性包括NUP93功能验证仅在小鼠细胞系中进行，存在跨物种限制；实验验证范围有限，仅对NUP93进行了功能分析；临床分型相关性受限于队列结果数据不完整等。未来结合前瞻性队列、人类来源模型的功能验证将有助于将这些发现转化为脓毒症管理的临床可行策略。

该研究通过多组学整合分析鉴定了四个关键MAG作为脓毒症诊断标志物，证实其分型价值，并首次揭示NUP93通过PINK1介导的线粒体自噬在脓毒症中的作用机制，为理解脓毒症异质性和开发靶向治疗策略提供了新的视角和工具。