跨膜蛋白TMEM145作为耳蜗外毛细胞静纤毛连接结构的关键组分并介导stereocilin与tubby分泌的功能解析

《Nature Communications》：TMEM145 is a key stereociliary component in the link structures of outer hair cells and mediates the secretion of stereocilin and tubby

　　本研究针对耳蜗外毛细胞(OHC)静纤毛连接结构中关键蛋白缺乏跨膜域这一科学问题，揭示了跨膜蛋白TMEM145在水平顶部连接体(HTCs)和覆膜附着冠(TM-ACs)形成中的核心作用。研究人员通过构建Tmem145基因敲除(KO)小鼠模型，结合听觉功能检测、扫描电镜、免疫共沉淀等技术，证实TMEM145与stereocilin(STRC)和tubby(TUB)相互作用并介导其分泌，为理解遗传性听力损失的分子机制提供了新见解。

　　

在人类感官世界中，听觉扮演着不可或缺的角色，而内耳中微小的毛细胞则是将声波机械振动转化为神经信号的关键转换器。其中，耳蜗外毛细胞(OHC)的静纤毛束结构尤为精密，它们通过多种细胞外连接结构相互联系并锚定在覆膜(TM)上，包括连接相邻静纤毛的水平顶部连接体(HTCs)以及将最长静纤毛与覆膜相连的附着冠(TM-ACs)。这些结构的完整性对于声音放大和频率调谐至关重要。然而，构成这些连接的关键蛋白，如stereocilin(STRC)、otogelin(OTOG)、otogelin-like(OTOGL)和tubby(TUB)，均缺乏跨膜结构域，这引出了一个核心科学问题：这些蛋白是如何被运输、锚定到静纤毛膜上并最终分泌到细胞外空间发挥功能的？寻找能够与这些蛋白相互作用、具有跨膜结构的核心锚定蛋白，成为理解听觉生理学中这一关键环节的突破口。

为了解决这一问题，由韩国延世大学医学院的Jae Won Roh、Kyung Seok Oh等研究人员领导的研究团队，在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们发现了一个名为TMEM145的跨膜蛋白，该蛋白包含一个高尔基体动态(GOLD)结构域和七个跨膜区域，是外毛细胞静纤毛连接结构的关键组分，并介导了STRC和TUB的分泌。TMEM145的缺失会导致小鼠出现严重的听力障碍和静纤毛连接结构的破坏。

研究人员首先通过生物信息学分析预测了TMEM145的结构，发现其N端为GOLD结构域，随后是七个跨膜区域。单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录学分析显示，Tmem145在小鼠耳蜗中主要在外毛细胞和螺旋神经节神经元(SGNs)，特别是I型SGNs中表达。为了探究其功能，研究团队利用CRISPR-Cas9技术构建了Tmem145基因敲除(KO)小鼠(Tmem145^-/-)。听觉脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)测试表明，Tmem145^-/-小鼠在出生后21天(P21)就表现出严重的听力损失，且DPOAE信号完全消失，提示外毛细胞功能严重受损。

扫描电子显微镜(SEM)观察发现，虽然Tmem145^-/-小鼠的外毛细胞数量在早期并未明显减少，但其静纤毛束排列紊乱，TM-ACs和HTCs结构完全缺失，覆膜上的印记也消失了。然而，更精细的连接结构——顶连(tip links)得以保留，外毛细胞的马达蛋白prestin的功能也正常。这些结果表明，TMEM145的缺失特异性地破坏了TM-ACs和HTCs，进而导致听力功能障碍。

免疫荧光染色和免疫电镜进一步证实，TMEM145蛋白特异性地定位在外毛细胞静纤毛的TM-ACs和HTCs区域。其表达随着耳蜗发育呈从基底转向顶转的梯度模式。在发育早期(P5)，Tmem145^-/-小鼠的静纤毛结构尚正常，但随着发育成熟(P21)，其结构紊乱变得明显，说明TMEM145对于维持成熟静纤毛的结构稳定性至关重要。

为了阐明TMEM145的作用机制，研究人员在HEK293T细胞中进行了体外实验。免疫共沉淀(co-IP)结果表明，TMEM145能够与STRC和TUB发生物理相互作用。通过构建缺失突变体，他们发现TMEM145的GOLD结构域负责与STRC结合，而其跨膜区域则负责与TUB结合。更重要的是，TMEM145的存在促进了STRC和TUB分泌到细胞外培养基中，而TMEM145本身并不被分泌。在表达内源性TMEM145的Neuro-2a细胞中，TUB能够被分泌，而在不表达TMEM145的HEK293T细胞中则不能，这进一步支持了TMEM145在蛋白分泌中的关键作用。

体内研究显示，在Tmem145^-/-小鼠中，STRC和TUB无法正常定位到静纤毛尖端。反之，在Strc^-/-、Otog^-/-以及tub/tub; Mapla^B6小鼠（其TM-ACs和HTCs缺失）中，TMEM145也发生了错误定位。然而，在tub/tub; Mapla^AKR小鼠（其TM-ACs存在而HTCs缺失）中，TMEM145仍能定位在TM-ACs上。这表明这些蛋白之间存在复杂的相互依存关系。作为对照，在Pmca2^+/-、Tecta^-/-和Adgrv1^-/-小鼠（这些基因的蛋白产物不直接参与TM-ACs/HTCs）中，TMEM145的定位未受影响，说明其错误定位具有特异性。

本研究综合运用了基因敲除小鼠模型构建、听觉生理功能检测（ABR, DPOAE）、扫描电子显微镜(SEM)、免疫荧光染色与免疫电镜、单细胞RNA测序(scRNA-seq)与空间转录学、细胞培养与转染、免疫共沉淀(co-IP)与蛋白质印迹(Western blot)、细胞表面生物素化标记以及结构生物信息学分析（AlphaFold预测）等关键技术方法。小鼠样本来源包括实验室构建的Tmem145 KO鼠以及从杰克逊实验室等机构购买或合作获取的Strc KO、Tecta KO等多种遗传背景的模型鼠。

TMEM145 localization in the OHC stereocilia

研究人员通过特异性抗体证实TMEM145蛋白定位于外毛细胞静纤毛的TM-ACs和HTCs结构。其表达在耳蜗发育过程中呈现从基底转向顶转的时空特异性。TMEM145在出生后早期（P5）即开始表达，并在静纤毛成熟后（P21）持续存在，其缺失导致静纤毛结构的进行性紊乱。

TMEM145 interacts with STRC and TUB to facilitate their secretion

生化实验证明TMEM145通过其GOLD结构域与STRC相互作用，并通过其跨膜结构域与TUB相互作用。更重要的是，TMEM145是STRC和TUB分泌所必需的因子，其功能类似于WLS蛋白在WNT分泌通路中的作用。

Structural interactions among proteins that comprise the ultrastructure of OHC stereocilia

体内实验揭示了TMEM145、STRC、TUB、OTOG等蛋白在静纤毛超微结构形成中的相互依存关系。TMEM145的缺失导致STRC和TUB无法定位，而STRC或OTOG的缺失同样会影响TMEM145的定位，表明这些蛋白共同构成一个功能复合体。

综上所述，本研究首次将TMEM145确立为维持外毛细胞静纤毛TM-ACs和HTCs结构完整性的关键跨膜支架蛋白。它不仅通过其独特的结构域分别与胞外侧的STRC和胞质侧的TUB相互作用，还直接介导了这些蛋白的分泌过程。TMEM145功能的丧失会导致静纤毛连接结构的崩溃和严重的听力损失。这一发现极大地增进了我们对听觉转导分子机制的理解，特别是揭示了静纤毛细胞外基质蛋白组装和锚定的新机制，为未来研究与STRC、OTOG等相关的人类遗传性听力损失（如DFNB16, DFNB18B）提供了新的分子视角和潜在的治疗靶点。同时，TMEM145在螺旋神经节神经元中的表达也提示其可能在听觉神经通路中扮演尚未被完全揭示的角色，值得进一步探索。