有机阴离子转运蛋白PGT摄取前列腺素E2的分子基础：结构、机制与疾病意义

《Nature Communications》：Molecular basis of prostaglandin E2 reuptake by organic anion transporter PGT

　　本研究针对前列腺素(PGs)信号过度激活引发的病理状态，聚焦于关键清除蛋白前列腺素转运蛋白(PGT/SLCO2A1)。研究人员通过冷冻电镜技术解析了人源PGT在不同寡聚化状态和底物结合状态下的高分辨率结构，揭示了其独特的Kazal样胞外结构域功能、PGE2识别机制及二聚化现象。该研究不仅阐明了PGT转运前列腺素的分子基础，还为理解其双功能角色（转运蛋白与Maxi-Cl通道组件）提供了结构视角，对开发针对慢性炎症、骨骼疾病和心血管疾病的特异性疗法具有重要意义。

　　

前列腺素是人体内一类具有强大生物活性的脂质信号分子，如同精准的化学信使，在炎症反应、生殖过程、血管通透性调节等生理活动中扮演着关键角色。然而，这些信使的活性必须被精确控制，一旦过量产生或清除不及时，其持续的信号传导就会从保护性作用转变为破坏性力量，导致慢性炎症、疼痛、高血压甚至癌症等多种疾病。因此，及时清除多余的前列腺素，如同及时熄灭信号弹，对于维持机体稳态至关重要。这一清除任务的主要执行者之一，便是高亲和力的前列腺素转运蛋白（PGT，也称为SLCO2A1）。

PGT属于主要协助子超家族（MFS）转运蛋白，负责将细胞外的前列腺素（如PGE₂）重新摄取到细胞内，进而被15-酮前列腺素脱氢酶（15-PGDH）氧化失活，从而终止其信号传导。PGT的功能失常与多种人类疾病密切相关。例如，其功能丧失性突变会导致原发性肥大性骨关节病（PHO）和SLCO2A1基因相关慢性肠病（CEAS），患者通常表现出血浆PGE₂水平升高和持续炎症。此外，PGT还被发现是Maxi-Cl阴离子通道的核心组分，但其如何在这两种截然不同的功能（特异性转运与离子通道）之间转换，一直是个未解之谜。理解PGT的工作机制，不仅有助于揭示这些疾病的发病机理，也为开发靶向PGT的新型疗法（如非激素类避孕药、抗高血压药物）提供了可能。然而，长期以来，由于缺乏PGT的高分辨率三维结构，科学家对其如何识别和转运前列腺素分子、如何调控其功能等基本问题知之甚少。

为了解决这一难题，由复旦大学眼耳鼻喉科医院、生物医学研究院的瞿倩慧研究员、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的李典藩研究员、上海中医药大学附属市中医医院的白倩研究员以及李耀辉博士等带领的研究团队，在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表了他们的最新研究成果。他们利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了人源PGT在无底物（Apo）、结合底物PGE₂以及二聚体状态下的多种高分辨率结构，并结合生化实验和分子动力学（MD）模拟，深入揭示了PGT识别和转运PGE₂的分子基础，并对其潜在的通道功能提出了新的见解。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下关键技术方法：利用HEK293F悬浮细胞表达人源全长PGT蛋白，并通过链霉亲和素色谱和凝胶过滤层析进行纯化；采用单颗粒冷冻电镜技术解析PGT的不同构象结构；通过放射性同位素标记的³H-PGE₂摄取实验评估PGT及其突变体的转运活性；利用微尺度热泳动（MST）技术测定PGT与PGE₂的结合亲和力；借助分子动力学模拟分析底物结合和结构动态变化；通过化学交联和二硫键突变分析验证PGT在细胞膜环境中的二聚化现象；并将PGT重组到脂质纳米盘（Nanodisc）中以模拟更接近天然的膜环境。

结构解析与整体架构

研究团队首先解析了无底物状态下PGT的冷冻电镜结构（PGT_apo），分辨率达到3.14 ?。PGT呈现出类似齐特琴的不规则梯形结构，包含一个巨大的胞外结构域（ECD）、一个跨膜结构域（TMD）和一个较小的胞内结构域（ICD）。其TMD具有典型的MFS折叠，由两个伪对称的螺旋束（N端结构域TM1-TM6和C端结构域TM7-TM12）组成，处于外向开放构象。一个显著特征是PGT拥有一个独特的“伞状”ECD，遮蔽了面向胞外空间的底物转运通道入口。该ECD富含二硫键，其中包含一个Kazal样结构域，该结构域在SLCO家族成员中高度保守。

富含二硫键的ECD与Kazal样结构域的功能

研究发现，ECD主要由连接TM9和TM10的长环ECL5构成，其核心是一个由四个二硫键稳定的Kazal样结构域。删除该Kazal样结构域（PGT_Δ425-508）会导致PGT无法正常定位到细胞膜表面，表达量显著降低，并且完全丧失了PGE₂摄取活性，表明该结构域对于PGT的稳定性和膜定位至关重要。有趣的是，删除另一个胞外环ECL2（PGT_Δ135-165）虽然不影响膜定位和蛋白表达，却显著改变了PGT的转运动力学，表现为最大速率（V_max）和米氏常数（K_M）同时升高，结合亲和力下降。分子动力学模拟显示，ECL2的缺失增加了Kazal样结构域的灵活性，研究人员推测ECL2可能通过限制PGT的整体构象变化来精细调控其转运活性。

中央底物结合位点的识别机制

为了揭示PGE₂的识别机制，研究人员在加入PGE₂后解析了PGT的结构。在一个高分辨率（2.96 ?）结构（PGT_cen）中，他们观察到一个清晰的L形密度，与PGE₂分子的形状完美契合，位于TMD的中心位置。PGE₂以紧凑的L形结合在一个由疏水和带正电/极性残基组成的复合口袋中。其羧基基团与Arg561形成盐桥；中间的环戊烷环由Phe212支撑，周围有Ser215、Pro219和Met380；烷基链则嵌入由Phe557、Met560和Trp565形成的疏水凹槽中。对这些关键残基进行点突变（如Q42A, R561E, W565A等）会严重削弱或完全消除PGE₂的转运活性，证实了这些相互作用的重要性。

侧向入口的底物选择

在另一个分辨率稍低（4.01 ?）的PGE₂结合结构（PGT_len）中，研究人员观察到一个截然不同的PGE₂密度。该密度呈棒状，从TM2和TM11之间的侧向V形开口延伸至转运通道中心。在此构象中，PGE₂呈现伸展的直线形，其羧基端被TM1上的Lys53静电吸引。K53E突变会显著降低转运活性，说明该位点的正电荷对于初始吸引带负电的PGs至关重要。分子动力学模拟表明，这种侧向结合的构象不稳定，但在一部分模拟中，PGE₂能够从该位置翻转到中央结合位点，提示了其可能的转运路径。

疾病相关突变的结构诠释

研究团队将已知的PHO和CEAS相关PGT突变映射到结构上，从结构生物学角度解释了其致病机制。许多错义突变发生在构成转运通道的TM4、TM5、TM8和TM11上。例如，直接与PGE₂相互作用的Trp565突变会破坏底物结合。TM5上的Pro219引入了一个转角，对塑造中央结合腔至关重要，其突变（P219L）虽不影响膜定位，但显著降低了底物结合亲和力和转运活性。另一个常见突变G222R，虽然不直接接触底物，但引入带电荷的大侧链Arg会引起与邻近残基的空间和静电冲突，并可能破坏TM5的螺旋弯曲，导致蛋白表达量下降和功能几乎完全丧失。发生在Kazal样结构域上的突变（如P457L, G460R等）则可能影响蛋白的正确折叠和膜表达。

PGT的二聚化及其潜在功能

除了单体结构，研究人员在去垢剂胶束和脂质纳米盘环境中均观察到了PGT的二聚体。通过合并数据集，他们获得了分辨率为3.16 ?的二聚体结构（PGT_dd）。二聚化界面主要由TM8和TM10的膜内侧通过疏水相互作用介导，埋藏面积达2250 ?2。化学交联和设计的二硫键交联实验在细胞膜样本中证实了二聚体的生理存在。值得注意的是，在二聚体结构中，ECD和TM12变得高度柔性而无法解析，且C端结构域的跨膜螺旋发生了显著重排：TM9旋转了30°，TM7和TM11向外摆动，导致底物结合口袋被破坏。这解释了为何在含有PGE₂的二聚体样本中观察不到底物密度。二聚化可能使PGT锁定在一种不利于转运功能的构象。鉴于PGT是Maxi-Cl通道的核心组分，这种二聚化界面以及由此引起的构象动态变化，可能为理解其通道功能提供了结构线索。研究人员推测，二聚化可能破坏了胞外侧的门控机制（Gate 1），使PGT更倾向于形成一种单门控的通道样构象，从而允许离子顺电化学梯度快速通过。

研究结论与意义

本研究通过多构象PGT结构的解析，首次在原子水平上揭示了PGT识别和转运其核心底物PGE₂的精细机制。研究不仅确认了中央结合位点的关键残基，还捕捉到一个可能代表侧向入口的中间状态，支持了PGs分子在转运过程中发生翻转的模型。研究还强调了富含二硫键的Kazal样胞外结构域在蛋白稳定和膜定位中的不可或缺作用，并从结构角度阐明了多种致病突变破坏PGT功能的分子基础。尤为重要的是，本研究发现了PGT在膜环境中形成二聚体的现象，并揭示了二聚化引起构象变化进而可能影响其功能，这为理解PGT在转运蛋白和Maxi-Cl阴离子通道这两种角色之间的潜在转换提供了全新的结构框架。这些发现深化了对前列腺素信号终止机制的理解，也为未来开发靶向PGT治疗相关疾病（如PHO、CEAS、炎症性疾病和心血管疾病）的精准药物奠定了坚实的理论基础。