Ei24缺失通过破坏线粒体ATP合成独立于UCP1引发棕色脂肪细胞冷应激致死性低温

《Nature Communications》：Ei24 deficiency in brown adipocytes induces severe hypothermia under cold stress independent of UCP1 activity

　　本研究揭示了Ei24在棕色脂肪组织（BAT）产热中的新机制。研究人员发现，脂肪细胞特异性敲除Ei24（EiaKO）的小鼠，其BAT出现线粒体嵴结构破坏、膜电位（ΔΨm）消散、基质pH降低，导致ATP合成严重受损。尽管解偶联蛋白1（UCP1）表达和活性未变，但ATP耗竭破坏了UCP1介导产热所需的线粒体环境，并损害了SERCA介导的钙循环和肌酸底物循环等ATP依赖性无效循环，最终致使小鼠在冷应激下出现致死性低体温。该研究明确了Ei24是通过维持ATP合酶功能来保障产热的关键调节因子，为理解BAT产热的能量调控提供了新视角。

　　

当环境温度骤降，哺乳动物会启动一种高效的产热机制来维持体温——这就是棕色脂肪组织（BAT）的功劳。不同于储存能量的白色脂肪，棕色脂肪细胞富含线粒体，其独特的解偶联蛋白1（UCP1）能利用质子梯度将底物氧化释放的能量直接转化为热量，而非合成ATP，这一过程称为非颤抖性产热。然而，产热过程的精细调控远不止UCP1这么简单。近年来，科学家们发现，即便UCP1功能正常，某些基因缺陷仍会导致严重的耐寒能力下降，这提示我们，维持线粒体自身的结构和功能完整性，或许是保障高效产热的另一关键环节。

在这一背景下，一个名为“依托泊苷诱导2.4”（Ei24，也称PIG8）的基因引起了研究人员的注意。Ei24最初作为p53的靶基因在肿瘤抑制和基础自噬中被广泛研究，但其在代谢活跃组织，尤其是BAT中的生理功能尚不明确。有趣的是，对肿瘤数据库的分析显示，Ei24高表达的肿瘤显著富集于脂肪酸代谢相关通路，而其在脂肪细胞中的表达也与脂肪生成和脂肪酸代谢基因网络密切相关。这些线索促使研究人员深入探究Ei24在BAT这一“产热工厂”中扮演的具体角色。

为了回答这一问题，Su Bin Lee、Bui Thanh Thu等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们构建了脂肪细胞特异性（EiaKO）和棕色脂肪细胞特异性（EibKO）敲除Ei24的小鼠模型，惊奇地发现，这些小鼠在常温下并无异常，但一旦遭遇4°C的冷刺激，便会迅速出现致命性低体温，全部无法存活。进一步探究发现，Ei24缺失的BAT发生了显著的肥大和脂质积聚，脂滴（LDs）变得大而少，呈现出类似白色脂肪的“单房”形态。更重要的是，尽管UCP1的表达量和活性在敲除鼠中并未改变，但其线粒体内部却出现了严重的结构功能紊乱：嵴结构破坏、膜电位（ΔΨ_m）消散、基质pH降低，最终导致ATP合成能力严重受损。

机制上，研究人员发现Ei24与ATP合酶亚基ATP5A/B存在直接的蛋白相互作用，且在β3-肾上腺素能受体激动剂CL316,243或福司柯林（forskolin）刺激后，这种相互作用会增强。通过截断体筛选，他们鉴定出Ei24的C端区域（氨基酸293-340）是恢复ATP合成的关键功能域。这意味着Ei24如同一个“分子扳手”，直接作用于ATP合酶这一“能量转换器”，确保其在产热需求下高效运转。

这种生物能量缺陷带来的后果是连锁性的。首先，它破坏了UCP1有效介导产热所必需的线粒体环境（如质子梯度）。其次，它严重影响了另外两条依赖ATP的产热途径：内质网上的SERCA泵介导的钙循环和肌酸底物循环。实验表明，EiaKO细胞在SERCA激动剂CDN1163刺激下，内质网钙离子回填能力显著减弱；同时，冷应激本应诱导的肌酸激酶B型（CKB）基因表达在敲除鼠BAT中也几乎无响应。这两条途径都是消耗ATP产生热量的“无效循环”，它们的失灵进一步加剧了产热障碍。

值得注意的是，Ei24的缺失并未影响小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，在正常饲养条件下其寿命也与野生型小鼠无异。这表明，Ei24的功能缺失主要是在应对环境应激（如寒冷）时才凸显其生理重要性。此外，研究人员在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中也验证了Ei24对ATP合成的调控作用，提示其功能可能具有普适性。而在白色脂肪组织中，Ei24敲除导致了线粒体增多和形态异常，但这种“假性褐变”并未改变其储存脂质的核心功能。

为开展此项研究，作者团队运用了多项关键技术：利用CRISPR-Cas9系统构建了Ei24条件性基因敲除（EicKO）小鼠模型，并与脂肪组织特异性（Adipoq-Cre）或棕色脂肪特异性（UCP1-Cre）Cre小鼠杂交，获得EiaKO和EibKO小鼠；通过透射电子显微镜（TEM）观察了线粒体的超微结构；采用Seahorse细胞能量代谢分析系统测量了线粒体的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）；利用JC-1和TMRM荧光探针评估了线粒体膜电位（ΔΨ_m），使用SNARF-1 AM探针测定了线粒体基质pH；通过免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质印迹（Western Blot）验证了Ei24与ATP合酶亚基的相互作用；采用ATP生物发光法检测了细胞内ATP浓度；并利用G-CEPIA1er钙离子探针评估了内质网钙循环功能。研究所用棕色脂肪细胞来源于小鼠基质血管组分（SVFs）的原代分离和诱导分化。

Adipocyte-specific depletion of Ei24 induces brown adipose tissue hypertrophy

研究人员首先成功构建了脂肪细胞特异性Ei24敲除（EiaKO）小鼠模型。与野生型对照相比，EiaKO小鼠的体重未见显著变化，但其肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）的相对重量增加了两倍以上，且组织切片显示脂滴（LDs）体积显著增大，呈现出肥大特征，而腹股沟白色脂肪（iWAT）和附睾白色脂肪（eWAT）则无此变化。

Physiological and metabolic effects of Ei24 KO, leading to lethal hypothermia

在冷应激测试中，所有EiaKO小鼠在4°C环境中均出现严重低体温并死亡，而野生型小鼠仅体温轻微下降且全部存活。组织学分析显示，冷暴露后野生型BAT脂滴明显缩小，而EiaKO BAT脂滴变化不大，提示其脂质利用障碍。尽管空腹6小时体重下降相似，但随后在低温下自由进食时，EiaKO小鼠体重恢复更快，血清游离脂肪酸（FFA）水平升高，表明其食物能量转化为热量的效率低下。葡萄糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT）试验未显示两组存在差异。

Ablating adipocyte Ei24 induces lipid-droplet accumulation in BAT

EiaKO小鼠BAT中脂滴变得大而少。虽然脂解关键酶ATGL的蛋白和mRNA表达上调，但HSL的磷酸化水平未变，体外培养的SVF细胞也显示其脂解和脂合成速率与野生型无异。然而，脂肪酸氧化（FAO）速率在EiaKO来源的SVF细胞中显著降低，且FAO相关基因（如Cpt1a）对冷刺激的适应性反应受损，说明脂质积聚主要源于脂肪酸氧化利用障碍，而非合成或分解异常。

Ei24 ablation induced crista dysmorphia and abnormal mitochondrial accumulation

透射电镜（TEM）揭示EiaKO棕色脂肪细胞胞质中充满了大量形态异常的小线粒体，约57%的线粒体出现嵴结构断裂或空泡化，线粒体平均面积不足野生型的一半。同时，线粒体膜电位（ΔΨ_m）显著去极化，基质pH降低。细胞ATP水平严重下降，且更依赖糖酵解供能。用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理并未影响ATP水平，提示Ei24对ATP合酶的功能调控可能独立于其自噬作用。

Ei24 is essential for proper ATP synthase function

免疫共沉淀证实Ei24与ATP合酶亚基ATP5A/B存在相互作用，且该作用在β3-肾上腺素能受体激动后增强。功能域映射分析表明，Ei24的C端区域（aa 293-340）对于恢复ATP合成至关重要。亚细胞分级和免疫荧光显示，冷刺激或CL316,243处理后，Ei24在线粒体中的定位增加。Seahorse能量代谢分析显示，EiaKO细胞在CL316,243刺激下耗氧率（OCR）增幅显著低于野生型，且ATP合成的调节灵活性丧失。尽管从EiaKO小鼠分离的线粒体对UCP1激活剂（棕榈酸）和抑制剂（GDP）的反应与野生型相似，表明UCP1本身活性正常，但ATP依赖的产热途径（如SERCA钙循环和肌酸循环）均出现功能缺陷。

Hypothermic defects were reproducible in EibKO mice

为了排除白色脂肪的旁分泌影响，研究人员构建了棕色脂肪特异性Ei24敲除（EibKO）小鼠。EibKO小鼠重现了EiaKO的表型：BAT肥大、冷暴露下体温急剧下降。这表明低温表型源于BAT自身的功能障碍。最后，在EiaKO细胞中重新表达Ei24（RE）能够完全挽救ATP水平、线粒体膜电位和基质pH，确证了Ei24在维持线粒体功能中的核心作用。

综上所述，本研究揭示了Ei24在棕色脂肪产热中一个不依赖于UCP1的全新调控机制。Ei24通过其C端区域与ATP合酶相互作用，是维持线粒体嵴结构完整性、膜电位和质子梯度，从而保障高效ATP合成的关键因子。Ei24缺失导致ATP耗竭，不仅破坏了UCP1发挥功能所依赖的线粒体环境，也使得SERCA钙循环和肌酸底物循环等ATP依赖的产热途径失灵，最终导致动物在冷应激下无法维持体温而死亡。这项工作将Ei24确立为线粒体生物能量学的核心调节因子，深化了我们对棕色脂肪产热多层次调控网络的理解，为治疗肥胖、糖尿病等代谢性疾病中可能存在的产热障碍提供了新的潜在靶点。