CRY1通过调控DNA末端切除的昼夜节律振荡影响同源重组修复与肿瘤治疗响应

《Nature Communications》：Circadian regulation of homologous recombination by cryptochrome1-mediated dampening of DNA end resection

　　本研究揭示了昼夜节律核心组分CRY1通过调控DNA末端切除过程影响DNA双链断裂修复路径选择的新机制。研究人员发现CRY1通过与CCAR2相互作用抑制CtIP介导的末端切除，从而调控同源重组修复效率，该过程受到DNA-PK磷酸化修饰的精细调控。该研究不仅阐明了昼夜节律与基因组稳定性维持的内在联系，还为肿瘤放射治疗的时序优化提供了理论依据。

　　

当夜幕降临，我们体内的细胞并非简单地进入休眠状态，而是遵循着精确的昼夜节律进行着复杂的生命活动。这种以24小时为周期的生物钟调控着从基因表达到代谢过程的众多生理功能。然而，令人惊讶的是，连维持生命最基础的DNA损伤修复系统也受到这种节律的调控。DNA双链断裂（DSB）是细胞中最危险的DNA损伤类型，如果修复不当，可能导致基因组不稳定甚至癌症发生。细胞通过两种主要途径修复DSB：精确的同源重组修复（HDR）和易出错的非同源末端连接（NHEJ）。这两种修复途径的选择关键在于DNA末端切除——这一过程通过降解断裂DNA末端产生单链DNA，为HDR提供必要前提。

尽管科学家早已知道核苷酸切除修复等DNA修复途径存在昼夜节律性，但关于更复杂的DSB修复途径是否受到类似调控，特别是同源重组这一精确修复机制是否遵循生物钟节律，一直是个未解之谜。西班牙塞维利亚大学Pablo Huertas教授团队在《Nature Communications》上发表的最新研究，首次揭示了昼夜节律核心组分CRY1如何通过精细调控DNA末端切除过程，影响同源重组修复效率，进而影响肿瘤的发生发展和治疗响应。

研究人员采用多种关键技术方法开展本研究：通过地塞米松和毛喉素同步化细胞昼夜节律，利用免疫荧光和ChIP-seq分析DNA修复蛋白动态变化；采用激光微辐照和活细胞成像技术实时观察蛋白招募；利用基因编辑和RNA干扰技术调控CRY1表达；通过临床样本回顾性分析和TCGA数据库挖掘验证临床意义；建立小鼠异种移植模型评估体内治疗效果。

DNA末端切除呈现昼夜节律性同步化

研究人员首先通过药物同步化技术将U2OS细胞的生物钟重置到"清晨"状态（CRY1低表达期），然后在不同时间点诱导DNA双链断裂。结果发现，DNA末端切除活性确实呈现明显的昼夜振荡：在同步化后0小时（相当于清晨）切除活性最高，随后逐渐下降，在12小时（相当于傍晚）达到最低点，24小时后再次升高。这种振荡模式在RPE1人原代细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中同样存在，且与细胞周期变化无关。进一步实验显示，切除DNA的实际长度也随昼夜节律变化，清晨产生的断裂具有更长的单链DNA尾。

DNA末端切除对CRY1水平作出响应

通过基因敲降实验，研究人员发现CRY1特异性（而非其同源物CRY2）负调控DNA末端切除。CRY1敲除不仅增强切除活性，还完全消除了昼夜振荡。相反，CRY1过表达或药物稳定化抑制切除过程。机制上，CRY1通过影响BRCA1（促切除因子）和RIF1（抗切除因子）在损伤位点的招募来调控切除活性。重要的是，CRY1水平直接影响同源重组效率，低CRY1促进RAD51依赖和非依赖的HDR，而高CRY1则抑制这一过程。

CRY1调控CtIP与CCAR2的拮抗关系

研究表明，CRY1与CCAR2和CtIP形成三元复合物，在DNA损伤位点共同发挥作用。CRY1通过增强CCAR2在损伤染色质上的滞留，抑制CtIP的活性释放。激光微辐照实验显示，CRY1被快速招募到DNA断裂处，其磷酸化状态影响CCAR2的滞留时间。CRY1缺失促进CCAR2从损伤位点解离，从而释放CtIP促进切除。

DNA-PK介导的CRY1磷酸化调控切除过程

DNA-PK对CRY1的磷酸化修饰是调控关键。CRY1的C末端含有DNA-PK特异性磷酸化位点，这些位点在CRY2中缺失。磷酸化模拟突变体（CRY1-3E）即使在没有DNA-PK活性时也能抑制切除，而非磷酸化突变体（CRY1-3A）则丧失此功能。活细胞成像显示，磷酸化促进CRY1在损伤位点的滞留，从而增强其抗切除功能。

CRY1水平影响基因毒性剂下的细胞存活

功能实验表明，CRY1水平直接影响细胞对DNA损伤剂的敏感性。低CRY1增强细胞对辐射和依托泊苷的抵抗，而高CRY1则增加敏感性。这种效应依赖于CRY1-CCAR2通路，双敲除实验显示两者处于同一遗传通路。临床数据分析进一步证实，高CRY1肿瘤表现出更强的HDR缺陷突变特征，但对放疗更敏感。

CRY1水平影响肿瘤生物学和预后

TCGA数据分析显示，CRY1高表达肿瘤具有更快的二次肿瘤发生速度和更强的HDR缺陷特征。重要的是，乳腺癌患者中，CRY1高表达者对放疗反应更好，生存期延长。回顾性临床分析发现，下午放疗（CRY1高峰期）的患者预后优于上午治疗者，但这种时间依赖性在CRY1表达紊乱的肿瘤（如肺癌）中消失。

该研究首次阐明了CRY1通过直接调控DNA末端切除介导同源重组修复的昼夜节律性，揭示了生物钟与基因组稳定性维持的新联系。这不仅深化了我们对昼夜节律生理功能的理解，也为肿瘤 chronotherapy（时序治疗）提供了重要理论依据。特别值得注意的是，这种调控机制在人类（日行动物）和小鼠（夜行动物）中呈现相反相位，提示其可能适应于不同物种的活动模式，而非简单地响应外界光照信号。未来研究将进一步探索这种昼夜调控在组织特异性、年龄和性别差异中的表现，以及其在癌症预防和治疗中的实际应用价值。