仿生双层水凝胶涂层修饰脱细胞鱼鳔基质：一种兼具抗钙化与抗血栓功能的心血管组织工程新策略

《Regenerative Biomaterials》：Biomimetic bilayer hydrogel coating with antithrombotic and anticalcification properties for cardiovascular tissue engineering application

　　本研究针对传统心血管植入材料易感染、钙化、血栓形成及生物相容性差等问题，开发了一种基于脱细胞鱼鳔基质（ASB）的仿生内皮双层水凝胶涂层（H/S）。通过透明质酸（HA）-铜-单宁酸（TA）自组装内层与甲基丙烯酸化丝素蛋白（SilMA）光交联外层的协同作用，该涂层显著提升了ASB的生物稳定性、力学性能、抗菌活性及抗钙化能力。体外血液循环模型和兔动静脉分流实验证实其优异抗凝血特性，大鼠颈动脉置换模型进一步验证其促进内皮化、抑制钙化和血栓形成的效果，为心血管组织工程支架提供了创新性表面功能化策略。

　　

心血管疾病是全球范围内导致死亡的主要原因之一，手术治疗往往需要采用合成材料或戊二醛（Glut）交联的生物材料来修复或替换受损组织。然而，这些材料存在明显的局限性：合成材料易引发感染，而Glut交联的生物材料则容易发生钙化，两者均存在生物相容性差、缺乏组织生长能力以及血栓形成风险高等问题。因此，开发兼具耐久性、良好生物相容性、抗感染、抗钙化和抗血栓特性的新型材料成为改善临床预后的迫切需求。

脱细胞细胞外基质（dECM）作为一种天然支架材料，具有良好的生物相容性和生物活性，被广泛应用于组织工程领域。尽管脱细胞处理能消除异种抗原和钙内流，从而减少钙化，但功能成分的丢失和胶原纤维的暴露会触发凝血、血小板活化和聚集，导致血栓形成，进而引发钙化。鱼鳔因其富含胶原、弹性蛋白和糖胺聚糖（GAG），且具有优异的力学性能和低抗原性、无人畜共患病毒风险等优势，成为心血管组织工程的理想候选材料。然而，其表面的血栓形成倾向仍是临床应用的重大挑战。

为此，研究人员设计了一种仿生内皮亲水双层水凝胶涂层，旨在同步解决抗钙化与抗血栓两大难题。该研究以脱细胞鱼鳔（ASB）为支架，通过层层自组装与光交联技术，构建了由内层HA-Cu-TA（HCT）水凝胶与外层甲基丙烯酸化丝素蛋白（SilMA）水凝胶组成的复合涂层（H/S-ASB）。内层HCT网络模拟内皮细胞糖萼结构，利用铜离子催化一氧化氮（NO）生成以促进内皮化、抑制血小板聚集；外层SilMA则凭借其亲水性和抗污特性，进一步减少蛋白质非特异性吸附和细胞黏附。此外，TA、铜和丝素蛋白固有的抗菌特性赋予涂层广谱抗菌能力。

研究通过扫描电镜（SEM）、衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）、能谱分析（EDS）等手段证实涂层成功构建并均匀覆盖ASB表面。力学测试显示H/S-ASB的极限拉伸强度显著优于Glut交联组。抗菌实验表明其对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）具有强效杀灭和生物膜抑制能力。体外溶血率低于5%，血小板黏附实验和闭环血液循环模型验证其优异血液相容性。兔动静脉分流实验中，H/S-ASB表面几乎无血栓形成。大鼠皮下植入及颈动脉置换模型进一步显示，该涂层显著促进内皮细胞覆盖和平滑肌细胞（SMC）浸润，且无钙化迹象。

关键技术方法包括：1）通过DNA含量测定（DAPI染色、定量分析）验证鱼鳔脱细胞效果；2）采用荧光标记HA（FITC-HA）和EDS mapping分析涂层成分分布；3）通过胶原酶和GAG酶降解实验评估生物稳定性；4）使用水接触角（WCA）和FITC-BSA吸附实验表征表面亲水性及抗蛋白吸附性能；5）通过血小板乳酸脱氢酶（LDH）和补体C3a激活水平量化血栓形成倾向；6）建立大鼠颈动脉置换模型（SD大鼠，150-200g）评价体内血管重塑与钙化情况。

3.1. H/S-ASB的制备与表征

研究人员首先对新鲜鱼鳔（FSB）进行脱细胞处理，获得ASB。DNA定量显示其含量低于50 ng/mg干重，HE和EVG染色证实胶原与弹性蛋白结构保留完整。随后通过浸泡HA溶液、CuSO₄和TA溶液构建HCT内层水凝胶，FITC-HA荧光分布和EDS铜元素映射证实成分成功锚定。外层SilMA经光引发剂LAP和UV照射交联后形成致密涂层，SEM显示H/S-ASB表面光滑且与基质结合紧密。

3.2. 交联度、生物稳定性、力学性能与抗菌活性

HCT-ASB和H/S-ASB的交联度分别达86.79%和89.16%，与Glut-ASB相当。胶原酶降解实验中，未交联ASB在14天内完全降解，而交联组重量损失均低于20%。GAG酶消化后，HCT组GAG含量稳定，显著优于Glut组。拉伸测试表明H/S-ASB极限拉伸强度最高。抗菌实验中，H/S-ASB对S. aureus和E. coli的杀菌率接近100%，且能有效抑制生物膜形成。

3.3. 生物相容性与抗钙化能力

CCK-8和活/死染色显示HUVEC和L929细胞在提取液中存活率超90%，符合ISO 10993-5标准。大鼠皮下植入30天后，H/S-ASB组细胞浸润良好，茜素红染色未见钙化，而Glut-ASB出现明显钙沉积。主要器官HE染色未发现毒性反应。

3.4. 体外血液相容性与抗凝血性能

所有ASB材料溶血率均低于2%。WCA测定显示H/S-ASB亲水性最佳（62.84°），FITC-BSA吸附实验其荧光强度最低（24.4%）。血小板黏附SEM和LDH检测证实H/S-ASB表面黏附血小板最少，C3a激活水平最低。闭环血液循环模型进一步验证其抗细胞黏附优势。

3.5. 离体动静脉分流抗凝血表现

兔颈动脉-静脉分流2小时后，ASB和Glut-ASB完全闭塞，HCT-ASB部分血栓形成，而H/S-ASB管腔清洁，SEM未见纤维蛋白沉积。

3.6. 原位血管置换性能

大鼠颈动脉植入1个月，H/S-ASB移植物保持结构完整，内皮标志CD34⁺细胞连续覆盖，α-SMA⁺平滑肌细胞深层浸润，且无钙化发生。

该研究成功开发了一种仿生双层水凝胶涂层技术，通过多重分子协同作用实现了心血管支架材料的多功能化改性。HCT内层模拟内皮生理功能，SilMA外层构筑物理屏障，二者结合显著提升材料的抗钙化、抗血栓、抗菌及促组织再生能力。尽管当前研究在小动物模型中展现出良好效果，但未来需在大动物模型及临床场景下进一步验证其长期稳定性与安全性。该策略为心血管组织工程支架的表面功能化提供了新思路，有望推动下一代抗钙化-抗血栓一体化植入材料的临床转化。