利用CRISPR/Cas9技术编辑ESK与GAD3基因协同提升番茄糖分、GABA及维生素C含量的研究

《Scientific Reports》：Enhancing tomato quality, high sugar content and GABA accumulation, with mutations in ESKs and GAD3 genes

　　本研究针对番茄营养品质提升的需求，通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对番茄SIESK1-3和SIGAD3基因进行定向突变。结果表明，突变体果实中可溶性糖含量提升至7.9% Brix，γ-氨基丁酸（GABA）积累量提高约5倍，维生素C含量增加1.5倍，并表现出显著的干旱胁迫耐受性。该研究为培育高营养价值的番茄品种提供了新策略。

　　

番茄作为全球广泛种植的作物，其营养价值日益受到关注。随着人们对功能性食品需求的增长，培育兼具高糖分和富含功能性成分（如γ-氨基丁酸GABA）的番茄品种成为研究热点。然而，传统育种方法周期长，且难以实现多性状的协同改良。基因组编辑技术，特别是CRISPR/Cas9系统，为作物精准育种提供了强大工具。此前，通过编辑SIGAD3基因已成功获得高GABA番茄并商业化。但如何同时提高番茄的糖分、GABA及其他营养成分（如维生素C），并理解相关基因的功能，仍是亟待解决的问题。

本研究由日本筑波大学的Kenji Miura和Hiroshi Ezura团队主导，旨在利用CRISPR/Cas9技术同时突变番茄中的SIESK1、SIESK2、SIESK3（ESKIMO1同源基因）和SIGAD3（谷氨酸脱羧酶3）基因，以期获得糖含量和GABA水平均显著提高的番茄新种质，并探究SIESK基因在番茄中的功能。

研究人员通过农杆菌介导法将构建好的CRISPR/Cas9载体（靶向SIESK1-3和SIGAD3）转化番茄子叶，获得再生植株。经过多代筛选和测序验证，获得了在目标位点发生突变的纯合株系（如EG Line 1和EG Line 2）。随后，他们对这些基因组编辑株系和野生型（WT）进行了系统的表型分析，包括植株生长、果实性状（大小、重量、糖分、GABA、维生素C含量）、花粉发育、茎部导管结构、以及对干旱和低温胁迫的耐受性。同时，利用RNA测序（RNA-seq）和基因本体（GO）富集分析，比较了编辑株系与野生型在果实成熟期的转录组差异，以揭示潜在的分子机制。

生长和坐果受损

与野生型（WT）相比，EG Line 1和EG Line 2均表现出明显的生长迟滞，株高显著降低。同时，编辑株系的坐果率急剧下降（WT为43.17%，EG Line 1为4.52%，EG Line 2为6.56%）。这种坐果率下降与花器官发育异常，特别是花粉形态异常和发育不良有关。茎部显微结构分析显示，在茎的上部和中部区域，编辑株系的导管面积显著小于WT，表明其水分运输效率可能受到影响。

EG Line1和Line2的果实性状差异

编辑株系的果实重量和直径均显著小于WT。然而，在营养品质方面，编辑株系表现出显著优势。其果实中的GABA积累量约为WT的5倍，可溶性固形物（Brix值）约为WT的1.8倍（WT约4.26%，编辑株系约7.9%）。对糖组成的进一步分析表明，葡萄糖含量在所有季节均显著升高，而蔗糖和果糖在春季显著升高。此外，由于RNA-seq提示维生素C生物合成相关基因上调，实验证实编辑株系的维生素C含量也比WT高出约1.5倍。

EG Line1和Line2表现出干旱胁迫耐受性但无低温胁迫耐受性

在干旱胁迫实验中，经过10天的断水处理，WT植株出现严重萎蔫，而EG Line 1和Line 2的受害程度较轻。对胁迫指标的分析显示，虽然编辑株系在正常条件下的丙二醛（MDA）和电解质泄漏（EL）基线水平高于WT，但在干旱胁迫后，WT的这些指标急剧上升，而编辑株系的变化相对平缓，表明编辑株系具有更强的干旱胁迫耐受性，细胞膜受损较轻。这种耐受性可能与脱落酸（ABA）生物合成关键基因SINCED1的表达上调有关。然而，编辑株系并未表现出像拟南芥esk1突变体那样的低温胁迫耐受性，其低温响应相关基因（如CBFs）的表达在正常条件下也未发生显著变化。

番茄果实中的RNA-seq和GO-term富集分析

对EG Line 2红熟果实的转录组分析发现，与WT相比，有302个基因显著上调，703个基因显著下调。GO富集分析显示，上调基因显著富集于维生素C生物合成、生长素（Auxin）信号通路、AUX/IAA家族基因、乙烯生物合成和代谢等过程。例如，与维生素C调节相关的Solyc05g054760.4（脱氢抗坏血酸还原酶1，DHAR1）显著上调。在糖代谢方面，多个与细胞壁多糖降解（如β-半乳糖苷酶、内切-β-1,3-葡聚糖酶前体）和淀粉降解（β-淀粉酶）相关的基因表达上调，这可能是导致可溶性糖含量升高的原因之一。下调基因则显著富集于应激反应（如热应激）、细胞壁生物合成、以及水分和脂质运输等相关过程。

本研究成功通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，同时靶向修饰番茄的SIESK1-3和SIGAD3基因，获得了营养品质显著提升的番茄新种质。突变体果实同时具备了高糖、高GABA和高维生素C的特性，并表现出对干旱胁迫的增强耐受性。研究表明，SIESK基因的突变可能导致植株维管系统发育异常（导管面积减小、次生细胞壁增厚减弱），引起类似干旱胁迫的状态，进而可能通过浓度效应和激活应激响应机制（如ABA信号通路和糖代谢相关基因表达改变）共同促使果实中糖分和抗氧化物质（如维生素C）的积累。SIGAD3基因的突变则直接解除了其对GAD3酶活性的自抑制，从而大幅提升了GABA的合成能力。

然而，这种营养品质的提升伴随着明显的生长权衡（Trade-off），表现为植株矮化、坐果率急剧下降，这可能是由于SIESK基因在维持正常生长发育和水分运输中的关键作用所致。该研究不仅验证了同时改良多个番茄品质性状的可行性，也为理解SIESK基因在番茄中的功能提供了新见解。研究成果为应对农业资源限制、降低高品质番茄栽培成本提供了潜在的新种质资源和技术思路。未来研究可着眼于如何通过更精细的基因编辑或栽培管理策略，在保持优良营养品质的同时，缓解其对产量的负面影响。该论文发表于《Scientific Reports》期刊。