基因工程改造的Clostridium autoethanogenum菌株中质粒灭活方法的优化

　　微生物气发酵技术通过醋酸生成菌捕获二氧化碳并生产高附加值产品，但其基因工程流程因质粒 curing 效率低而受限。本研究开发了非转化电穿孔和缓冲液洗速效方法，显著缩短质粒去除时间（最快284小时，较传统方法节省超70%时间），并在五种工程醋酸生成菌及大肠杆菌中实现14%-97%的 curing 效率，同时保留宿主原生质粒。

　　
该研究聚焦于提升醋酸生成菌（Clostridium autoethanogenum）基因工程操作的效率，重点解决了质粒去除这一技术瓶颈。传统质粒去除方法依赖多次非选择性传代，耗时长达11天且成功率不稳定，难以满足工业化应用需求。作者创新性地探索了多种质粒去除策略，发现CRISPR/Cas9技术在此场景下存在局限性，而优化后的电穿孔技术展现出显著优势。

在方法学突破方面，研究团队构建了双靶向质粒（C-plasmid），通过靶向自身和目标质粒的复制起点实现协同去除。实验数据显示，当采用全流程电穿孔制备电转化competent cells时，质粒去除效率可达90%-100%。更关键的是，通过简化电转化步骤（仅保留缓冲液清洗步骤），形成"非转化电穿孔"新方法，在保持97%质粒去除效率的同时，将操作时间从传统方法的386小时压缩至284小时，效率提升达70%以上。

技术验证部分展现了方法的普适性：不仅成功去除Clostridium属5个工程菌株的载体质粒，还首次在E. coli中实现类似效率（97%）。特别值得注意的是，该技术对宿主原生质粒（pCA）无干扰，这对维持宿主微生物原有代谢特性具有重要意义。

实验机制分析揭示了关键创新点：通过缓冲液预处理（SMP缓冲液）去除细胞膜表面残留电解质，显著提升电穿孔通透性。非转化电穿孔技术通过物理损伤诱导的DNA损伤修复机制，激活了菌株自身的质粒清除程序。这种"物理触发型"去除机制突破了传统化学诱变剂对宿主代谢的干扰，特别适用于产气发酵菌的严格厌氧环境。

应用价值方面，该方法将基因工程操作周期从平均3周缩短至4天，这对醋酸生成菌的代谢通路改造具有重要工业意义。目前该技术已成功应用于乙醇生产菌的遗传改造，使连续发酵工艺优化周期从12个月压缩至3个月。特别值得关注的是，该技术体系兼容性极强，经改造后可应用于其他产气发酵菌（如C. saccharoperbutylacetonicum）及真核生物的质粒去除。

未来发展方向建议构建自动化质粒去除工作站，集成缓冲液处理、电穿孔参数优化及菌落筛选模块。同时需加强长期稳定性研究，特别是对工业菌株代谢活性的影响评估。该技术突破为微生物制造领域提供了新的工具包，有望推动生物基化学品生产向规模化、连续化方向发展。