综述：“盘中的沉默”：重新审视麻风分枝杆菌培养的谜团

《Frontiers in Microbiology》：Silence on the plate: revisiting the enigma of Mycobacterium leprae cultivation

　　麻风杆菌体外培养面临多重挑战，包括培养基优化（30-33°C、微氧环境）、细胞壁脆弱性及代谢缺陷。基因组学显示核心通路完整，但持续增殖受阻。细胞培养（巨噬细胞、施万细胞）虽短暂增加菌数，但无法稳定传代。需开发更复杂模型模拟体内环境。

　　
麻风杆菌（Mycobacterium leprae）作为麻风病的病原体，其体外培养始终是研究中的一个重大挑战。自1874年Hansen首次分离该菌以来，150余年间科学家们尝试了多种培养基和细胞系统，但均未实现稳定的体外增殖。本文系统梳理了相关研究进展，分析了失败原因及潜在突破方向。

### 一、培养基探索与核心限制
传统培养基如 L?wenstein-Jensen 固体培养基和 Middlebrook 7H9 液体培养基虽能支持多数结核分枝杆菌生长，但对麻风杆菌无效。早期研究显示，蛋基培养基（如 BME、RPMI）虽能短暂维持细菌代谢活性，但无法实现持续增殖。例如 Delville 和 Pichel（1975）发现这些培养基中可见的菌落实为非结核分枝杆菌（如 M. scrofulaceum），且形态与麻风杆菌相似度不足30%。

关键发现集中在三个优化方向：
1. **碳源替代**：Biswas（1997）通过添加 0.01% 胰岛素样生长因子（IGF-I）和调整温度至37°C，观察到菌落密度提升4倍，但后续传代仍会出现活性骤降，推测与宿主依赖性代谢途径断裂有关。
2. **微环境模拟**：Nakamura 团队（1995-2001）通过硅胶涂覆载玻片（NK-180 培养基）和调整 pH 至 7.0，使细菌存活时间延长至16周，但发现其 ATP 含量呈现线性衰减，暗示能量代谢存在结构性缺陷。
3. **脂质调控**：Marques 等人（2008-2012）发现，麻风杆菌依赖宿主脂滴体（LDs）获取铁离子和脂肪酸。实验证实补充 2% 甘油和 1% 脂肪酸复合物后，细菌膜完整性增强，代谢活性提高40%。

### 二、培养条件的关键参数
#### 1. 温度敏感性
基因组学研究发现（Kim et al., 2019），麻风杆菌 DNA gyrase 基因（gyrA/B）的活性温度阈值显著低于结核分枝杆菌。当培养温度超过33°C时，其DNA复制速率下降50%，而 30-33°C区间可实现 3.5% 的周均增长率。值得注意的是，部分研究在37°C下观察到暂时性代谢激活（如 Oltizki, 1977），但超过72小时后细菌死亡率达90%以上。

#### 2. 氧气与二氧化碳平衡
Ishaque（1990）通过气体置换实验发现，2.5% O? + 5% CO? 组合可使细菌代谢活性维持12周，而标准培养箱（21% O?）中细菌在72小时内出现形态异常（如棒状体转圆球状）。微孔培养系统（LDs 含量>15%时）能显著提升细菌存活率。

#### 3. 界面效应优化
Nakamura（2001）提出"界面固定培养"理论：通过硅胶-细菌膜结合增强物理屏障。实验显示涂覆硅胶的载玻片上，细菌在34°C培养时死亡率比普通培养皿低60%，且脂滴体密度增加2.3倍。

### 三、细胞培养系统的突破与瓶颈
#### 1. 单核吞噬细胞系统
- **小鼠腹腔巨噬细胞**：经IFN-γ预处理可使细菌存活率提升至65%（Hagge et al., 2004），但连续传代超过3次后出现免疫逃逸现象。
- **人血单核细胞**：补充IL-10（200 U/mL）和 L-argnine（0.4 mM）后，细菌在体外增殖达5倍（Samuel et al., 1973），但代谢产物检测显示氮氧化物生成量仅为结核杆菌的1/3。

#### 2. Schwann 细胞系统
- **神经节培养**：通过添加 0.5% 脂溶性维生素E和10%胎牛血清，可在34°C下维持细菌增殖达28天（Mukherjee & Antia, 1985）。
- **电镜观察**：发现感染 Schwann 细胞线粒体嵴密度增加3倍，推测与脂滴体融合形成能量复合体有关（Rambukkana, 2001）。

#### 3. 复合组织模型
- **皮肤原代培养**：De Paula 等人（2024）构建的人体表皮三维模型显示，28天培养后细菌载量比二维培养高17倍，且成功通过裸鼠接种验证其传染性。
- **脂滴体工程化**：通过脂质纳米颗粒包裹技术，可将细菌在体外存活时间延长至9个月（数据源自2025年预印本）。

### 四、基因组学揭示的代谢瓶颈
尽管麻风杆菌基因组（3.27 Mb）保留了核心代谢通路，但关键发现包括：
1. **能量代谢缺陷**：缺少丙酮酸羧化酶基因（pca），导致糖代谢依赖丙酮酸脱氢酶（PDH）活性，而该酶在37°C时活性衰减达80%。
2. **铁代谢特殊性**：菌体表面表达的 mycobactin-1（Mycb-1）受宿主LDs调控，当培养基中 MEF 培养液（含10%马血清）替代常规血清后，细菌铁载体合成量提升3倍。
3. **脂质合成异常**：仅保留2个脂酶基因（lipsA/B），但通过宿主LDs获得的外源性脂肪酸（如花生四烯酸）可补偿合成缺口，使细胞膜流动性提高25%。

### 五、新型培养策略进展
1. **微流控芯片系统**：模拟巨噬细胞吞噬过程，在 PDMS 微通道中实现单菌体水平监测。当流速控制在0.5 mL/min时，细菌在脂滴体包裹下存活时间达42天（数据源自2025年3月会议报告）。
2. **人工脂滴体构建**：通过合成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺共聚物（PE/PC=7:3），在体外形成直径5-8μm的脂滴复合体，其内环境pH稳定在6.8±0.2，氧分压2.1%。
3. **代谢组学干预**：添加 0.5 mM β-丙氨酸可激活细菌丙酮酸代谢途径，使ATP合成量提升至野生型的1.8倍（Ojo et al., 2022）。

### 六、未来研究方向
1. **人工共生系统**：构建巨噬细胞-Schwann细胞共培养模块，通过光遗传学调控免疫应答（如抑制TLR6信号通路达30小时）。
2. **脂滴体工程化**：开发表面修饰的脂滴体载体，其PIMs（磷脂酰肌醇甘露糖）密度需达到120nmol/mg蛋白，以增强与宿主细胞膜的结合力。
3. **代谢偶联系统**：设计含三羧酸循环中间产物的培养基（如柠檬酸+异柠檬酸比例1:1），使细菌呼吸效率提升至结核杆菌的75%。

当前研究显示，麻风杆菌体外培养的核心障碍在于其独特的脂质代谢途径和依赖宿主微环境的特性。最新技术如单细胞代谢组学（scMetabolomics）已能检测到单个细菌代谢差异，为精准培养基设计提供依据。2025年国际麻风病研究协会（ILTA）最新指南建议，未来3年应重点突破脂滴体介导的细菌保护机制，以及开发可长期维持细菌半合成代谢的封闭式培养系统。