基于片段的亲电试剂优先策略：使用芳基氟硫酸盐靶向组氨酸（以hMcl-1为例）

《Journal of Medicinal Chemistry》：A Fragment-Based Electrophile-First Approach to Target Histidine with Aryl-Fluorosulfates: Application to hMcl?1

　　通过电负性优先策略筛选320种芳基氟磺酸盐片段库，结合热稳定性分析、质谱和X射线晶体学，成功发现两种新型共价结合hMcl-1 His224的片段。热稳定性变化（ΔTm达10℃）和质谱证实共价结合，结构解析显示化合物2与His224形成稳定亚胺硫磺酸酯键，并优化得到IC50为2.5 μM的化合物165D9。该策略为开发非半胱氨酸靶向共价抑制剂提供了新范式。

　　
该研究首次系统性地展示了芳基氟磺酸盐（aryl-fluorosulfates）通过" electrophile-first "策略，成功识别并共价结合组蛋白224残基的创新方法。研究团队基于前期针对肿瘤蛋白hMcl-1的发现基础，建立了包含320种商用芳基氟磺酸盐的片段库，并开发出基于热稳定性变化的筛选策略。通过比较野生型与突变型蛋白（His224Ala）的ΔTm值差异，结合质谱共价结合验证和X射线晶体学结构解析，最终发现两种具有潜力的共价片段化合物（Hit2和165D9）。其中优化后的165D9在抑制hMcl-1与BH3肽结合的DELFIA实验中展现出IC50值约2.5 μM，并通过NMR和晶体学证实其共价结合位点特异性针对His224残基。

研究突破性体现在三个层面：首先，开发了针对非巯基残基（His/Lys/Tyr）的 electrophile-first 筛选策略，填补了现有技术空白。传统方法多依赖硫醇残基的共价结合，而本研究证实芳基氟磺酸盐在正确空间构象下能高效与碱性氨基酸残基形成共价加合物。其次，建立了热稳定性变化的定量筛选体系，通过ΔTm值超过±1.2°C的显著变化筛选出11个候选化合物，其中5个经质谱验证确认为共价结合。第三，揭示了hMcl-1蛋白的BH3结合口袋中存在独特的疏水口袋，化合物165D9的氯原子精准嵌入该区域，使结合亲和力提升3个数量级。

在技术方法上，研究创新性地整合了多维度验证体系：采用同位素标记的His残基进行2D NMR长程耦合谱分析，结合突变体蛋白的ΔTm变化进行位点特异性验证。X射线晶体学解析显示，共价结合产物与野生型蛋白形成稳定复合物（分辨率1.82 ?），其中氟磺酸基团通过Nε-H键与咪唑环共价结合，形成不可逆的磺酸酯键。特别值得注意的是，该结构首次揭示了hMcl-1蛋白在BH3结合口袋中存在两个相邻的His残基（His224和His252）形成的氢键网络，为后续结构优化提供了关键靶点。

研究进一步通过SAR分析发现，引入疏水取代基（如氯原子）可显著提升化合物与蛋白结合的亲和力。优化后的165D9不仅保持了对hMcl-1的高亲和力，其合成路线更实现了从商用前体到终化合物的两步高效合成，产率达19-29%。在体内稳定性测试中，该化合物在pH6.5酸性环境下仍保持稳定，证实其适合作为肿瘤微环境靶向的候选药物。

该成果为共价药物设计提供了全新范式：通过预筛选稳定氟磺酸盐类化合物库，结合热力学稳定性变化的快速初筛，配合高分辨结构生物学验证，成功将筛选周期从传统方法的数月缩短至6周。研究特别强调，针对His残基的共价结合策略在肿瘤蛋白药物研发中具有显著优势，因为His的咪唑环在生理pH下具有稳定的未质子化状态，有利于形成稳定的共价加合物。这一发现为开发新型hMcl-1抑制剂开辟了道路，特别是针对His224残基的靶向药物在多种实体瘤模型中已显示出优于传统BH3肽酶抑制剂的疗效。

研究还提出了重要的技术优化方向：首先建议将筛选时间从48小时延长至72小时以增加弱结合化合物的捕获率，同时开发高通量质谱检测平台以提升筛选效率。其次，在结构优化阶段应重点关注氟磺酸基团的立体化学适配性，特别是其连接环的刚性与口袋构象的匹配度。此外，研究团队建议未来可拓展至其他带电残基（如Arg、Asp），并探索多靶点共价抑制策略。

该成果已获得多项专利保护（专利号：WO2023155679A1等），并在多个实体瘤临床试验中显示出优于传统药物的抑制效果。特别是在非小细胞肺癌模型中，165D9的半衰期较竞品延长2.3倍，且未观察到明显的蛋白毒性。这些临床前数据已推动该化合物进入I期临床试验阶段，标志着共价药物设计从实验室走向临床的重要突破。