I-BET151靶向NLRP3炎症小体调控细胞焦亡的抗炎机制与治疗潜力研究

《Scientific Reports》：I-BET151 modulates NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis and exhibits anti-inflammatory activity

　　本研究针对NLRP3炎症小体异常活化导致的炎症性疾病治疗难题，通过系统性筛选发现BET蛋白抑制剂I-BET151能够特异性抑制NLRP3炎症小体组装，显著降低IL-1β、IL-18等炎症因子释放和细胞焦亡。机制研究表明I-BET151直接靶向NLRP3蛋白，破坏NLRP3-NEK7/ASC复合物形成，在DSS诱导的结肠炎和CLP诱导的脓毒症相关急性肺损伤模型中均展现显著治疗效果，为NLRP3驱动性炎症疾病提供了新的治疗策略。

　　

在免疫学研究领域，NOD样受体家族pyrin结构域包含3（NLRP3）炎症小体作为细胞质内的重要多蛋白复合物，能够识别各种应激信号、外源性微生物和内源性危险信号，在免疫系统中扮演着关键角色。当NLRP3炎症小体异常或过度激活时，会导致慢性炎症，加剧病理状态并推动疾病进展。临床研究发现，NLRP3炎症小体在炎症性疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病的发生发展中起着核心驱动作用。

然而，NLRP3炎症小体的激活是一个精细且多步骤的复杂过程，其作为多聚体复合物的特性给靶向药物开发带来了巨大挑战。尽管已有大量抑制剂被报道，但由于各种原因均停留在临床前研究阶段。因此，寻找新型NLRP3炎症小体抑制剂对于相关药物的开发具有重要意义。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，吴旭等人将目光投向了I-BET151，一种选择性溴结构域和额外末端结构域（BET）蛋白抑制剂。既往研究表明I-BET151在类风湿关节炎滑膜纤维细胞和软骨细胞中能够抑制促炎细胞因子和基质降解酶的表达，并通过RANKL信号通路抑制破骨细胞生成，展现出抗炎潜力。但I-BET151对NLRP3炎症小体激活的调控作用尚不明确。

为了探究I-BET151的抗炎机制，研究团队首先通过建立的体外NLRP3炎症小体筛选模型，从化合物库中筛选发现I-BET151对IL-1β活性具有显著抑制作用。进一步机制研究表明，I-BET151能够靶向NLRP3蛋白，破坏NLRP3炎症小体组装，从而抑制IL-1β分泌和细胞焦亡。

研究团队采用了一系列关键技术方法开展实验：通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症因子水平，蛋白质印迹法（Western blot）分析蛋白表达，免疫共沉淀（Co-IP）研究蛋白质相互作用，高通量筛选评估化合物活性，分子对接模拟分析结合位点，并利用DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型和CLP诱导的脓毒症相关急性肺损伤（SALI）模型进行体内药效评价。所有动物实验均使用来自江苏集萃药康生物科技有限公司的C57BL/6J小鼠。

2.1. I-BET151的抗炎活性

研究人员通过LPS/尼日利亚霉素激活骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中的NLRP3炎症小体，建立化合物筛选平台。筛选发现I-BET151对IL-1β和IL-18的分泌具有良好的抑制作用，且细胞毒性较低。Hoechst 33342/碘化丙啶（PI）双染色评估显示，I-BET151以浓度依赖的方式降低细胞焦亡率，在40μM时达到近56%的抑制率。同时，I-BET151还能剂量依赖性地减少BMDMs中乳酸脱氢酶（LDH）的释放。

2.2. 化合物I-BET151抑制NLRP3炎症小体激活的广谱性和特异性

研究发现在LPS预处理的BMDMs中，I-BET151能有效抑制尼日利亚霉素、ATP或单钠尿酸盐（MSU）刺激引起的IL-1β和Caspase-1释放。然而，在Poly(dA:dT)（AIM2炎症小体诱导剂）或鼠伤寒沙门氏菌（NLRC4激活剂）刺激的培养上清液中未观察到显著抑制。这些实验证明I-BET151是一种广谱性NLRP3炎症小体抑制剂，同时对NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体相关亚型的激活缺乏效力，表明其是特异性NLRP3炎症小体抑制剂。

2.3. I-BET151不影响NLRP3炎症小体激活的启动阶段和组装蛋白的表达

为探究I-BET151对NLRP3炎症小体激活的阶段特异性抑制机制，研究人员评估了其对LPS/尼日利亚霉素预处理的BMDMs中Caspase-1和IL-1β分泌的药理作用。结果显示I-BET151以浓度依赖的方式有效抑制培养上清液中IL-1β和Caspase-1的释放。Western blot进一步证明细胞裂解物中pro-IL-1β、Caspase-1亚型（p45）和炎症小体组分（NEK7、NLRP3、ASC）的蛋白水平得以保留。实时定量PCR（qRT-PCR）分析显示I-BET151处理后NLRP3、NEK7和ASC的mRNA水平无显著变化。此外，上清液中TNF-α（NF-κB信号激活的下游蛋白）水平在I-BET151处理后未见显著变化，表明I-BET151对启动阶段无影响。

2.4. I-BET151不影响NLRP3炎症小体激活的上游信号

研究人员探讨了I-BET151是否通过影响线粒体损伤和活性氧（ROS）产生来影响NLRP3炎症小体激活。结果显示，添加尼日利亚霉素后线粒体出现显著损伤，线粒体ROS产生明显增加，但加入I-BET151后，线粒体损伤和线粒体ROS产生均无显著变化。

2.5. I-BET151影响NLRP3炎症小体激活的下游信号

NLRP3炎症小体激活会启动ASC寡聚化，形成ASC斑点，这对招募和激活Caspase-1至关重要。结果显示，LPS/尼日利亚霉素刺激诱导了强大的ASC斑点形成，而I-BET151以浓度依赖的方式抑制了这一过程，在20μM时观察到最大抑制。

2.6. I-BET151通过影响NLRP3炎症小体组装发挥抗炎活性

为阐明I-BET151如何破坏炎症小体组装，研究人员研究了其对关键相互作用的影响。使用Co-IP检测发现在LPS预处理的BMDMs中，尼日利亚霉素刺激显著增强了内源性NLRP3-NEK7相互作用，而I-BET151以浓度依赖的方式减弱了这种相互作用。一致的是，I-BET151浓度依赖性地抑制了ASC向NLRP3的招募。这些数据表明I-BET151通过阻断NLRP3-NEK7/ASC复合物的形成来破坏NLRP3炎症小体组装。

2.7. I-BET151靶向NLRP3蛋白并展现抗炎活性

为表征I-BET151与NLRP3之间的直接相互作用，研究人员展示了I-BET151与NLRP3的对接模型。I-BET151与NLRP3表现出强大的相互作用特征，具有复杂的非共价相互作用网络。具体而言，I-BET151与关键氨基酸残基（包括GLU160、ILE234、TYR381、PRO412、LEU413、TRP416和PHE508）发生广泛的疏水相互作用。此外，I-BET151结构中的咪唑环在与ARG167的π-π堆积相互作用中起关键作用。咪唑环上的氮原子与ARG167形成氢键，氮原子与ARG237也建立氢键。这些多方面的相互作用揭示了I-BET151与蛋白质之间复杂的分子识别。

2.8. I-BET151对DSS诱导的小鼠急性结肠炎的治疗作用

为评估I-BET151在NLRP3炎症小体驱动病理中的治疗潜力，研究人员采用了DSS诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠模型。研究发现DSS攻击诱导了明显的临床恶化，包括体重显著减轻和疾病活动指数升高。然而，I-BET151以剂量依赖的方式减弱了这些效应，高剂量组显示出体重减轻的显著逆转和疾病活动指数的正常化。结肠长度分析显示，高剂量I-BET151相较于正常组保留了结肠长度。组织病理学分析进一步证实了治疗效果，高剂量I-BET151显著减轻了DSS诱导的结肠结构破坏。机制上，I-BET151抑制了NLRP3炎症小体激活，表现为结肠组织匀浆中促炎细胞因子包括TNF-α、IL-6和IL-1β的减少。

2.9. I-BET151对SALI的治疗作用

为进一步评估I-BET151的治疗潜力，研究人员采用了CLP诱导的小鼠SALI模型。CLP给药诱导了明显的临床恶化，包括体重显著减轻，但I-BET151以剂量依赖的方式减弱了这些效应。未经治疗的脓毒症小鼠在CLP后7天内死亡率接近76%，而I-BET151给药赋予了剂量依赖的生存益处。CLP后24小时采集的肺组织组织病理学分析显示，脓毒症小鼠肺泡和间质空间存在大量炎症细胞浸润，而I-BET151治疗显著减轻了这种炎症细胞浸润并降低了组织病理学评分。此外，支气管肺泡灌洗液（BALF）样本收集显示，I-BET151给药剂量依赖性地降低了升高的细胞因子浓度。

本研究证实I-BET151通过抑制NLRP3炎症小体激活发挥抗炎活性。主要发现包括：I-BET151抑制BMDM细胞中IL-1β分泌和细胞焦亡；不影响NF-κB通路激活，也不影响NLRP3、ASC、NEK7、pro-Caspase-1和pro-IL-1β蛋白的表达；对NLRP3炎症小体表现出广谱性和特异性抑制；不影响NLRP3炎症小体激活的上游信号，但能影响下游信号ASC聚集的形成；靶向NLRP3蛋白，影响NLRP3炎症小体组装并发挥抗炎活性；在DSS诱导的结肠炎和CLP诱导的急性肺损伤小鼠模型中均表现出显著治疗效果。

NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡是与多种炎症性疾病发病机制密切相关的关键通路。本研究结果表明，I-BET151通过抑制IL-1β和IL-18的产生有效抑制BMDMs中的细胞焦亡，同时保持膜完整性和细胞活力。重要的是，I-BET151在测试的最高浓度（40μM）下也未表现出显著细胞毒性。这些发现表明I-BET151可在不影响细胞活力的情况下有效调节细胞焦亡，突出了其作为炎症性疾病治疗剂的潜力。

与这些广谱作用的BET抑制剂不同，I-BET151表现出独特的双重选择性：它能广谱抑制多种刺激剂（尼日利亚霉素、ATP和MSU）的NLRP3炎症小体激活，但不影响非经典通路。这种通路选择性抑制表明I-BET151特异性靶向NLRP3炎症小体组装，而非全局抑制上游启动或无关的炎症小体复合物。这种特异性对于治疗应用至关重要，因为它最大限度地减少了对稳态免疫反应的脱靶效应，同时直接解决病理性的炎症小体过度活跃。

本研究独特地揭示了I-BET151抑制NLRP3炎症小体激活的具体机制。研究发现I-BET151特异性靶向NLRP3炎症小体激活的组装阶段，不影响启动阶段，而是通过破坏NLRP3-NEK7相互作用和寡聚化，有效抑制ASC斑点形成。值得注意的是，早期研究表明I-BET151也能在转录水平调节炎症细胞因子产生。这些发现强调I-BET151可通过转录调控和翻译后干预发挥抗炎作用，取决于细胞环境和刺激。重要的是，在本实验环境中，I-BET151不影响NF-κB激活或炎症小体组分的表达，表明其对IL-1β释放的抑制独立于NF-κB介导的转录控制。

破坏NLRP3-NEK7相互作用代表了炎症小体相关疾病的验证治疗策略。本研究通过扩展这一范式，表明I-BET151直接阻碍NLRP3寡聚化和ASC招募，不依赖于翻译后修饰或NEK7结构改变。这种基于高亲和力NLRP3结合的作用模式，提供了一种新的药理学方法来解偶联炎症小体组装与上游启动信号。I-BET151疗效的分子基础通过分子对接得到了严格验证，揭示了与残基的疏水相互作用和与ARG167、ARG237的氢键。这些相互作用不仅稳定了I-BET151-NLRP3复合物，而且空间阻碍了NLRP3的寡聚化界面，从机制上解释了对ASC斑点形成的抑制。

此外，I-BET151的治疗潜力在DSS诱导的IBD和CLP诱导的SALI模型中得到进一步证实，其能提高生存率、减轻组织损伤并抑制炎症生物标志物的表达。这些发现与先前强调BET抑制剂抗炎作用的研究一致。然而，I-BET151独特地将NLRP3炎症小体特异性与保留的启动阶段功能相结合，避免全身性免疫抑制。这种双重优势，靶向病理性的炎症小体过度活跃同时保留生理免疫反应，将I-BET151定位为治疗NLRP3介导疾病的有前途候选药物。

尽管结果令人鼓舞，但本研究存在局限性。研究主要关注NLRP3炎症小体通路，需要进一步研究探索I-BET151发挥抗炎作用的其他潜在机制。未来研究还应调查I-BET151给药的最佳剂量和时间，以最大化治疗效果同时最小化潜在副作用。

总之，本研究结果证明I-BET151在DSS诱导的小鼠结肠炎和CLP诱导的急性肺损伤中均表现出显著治疗效果。其作用机制涉及I-BET151靶向NLRP3蛋白，影响NLRP3炎症小体组装，从而抑制IL-1β和IL-18等炎症因子的释放。本研究阐明了I-BET151抗炎作用的潜在机制，为其药物开发提供了坚实的实验基础。这些发现也为针对NLRP3炎症小体驱动的炎症性疾病的治疗药物开发提供了新的见解和方向。然而，尽管实验结果令人鼓舞，但I-BET151在人类疾病中的疗效和安全性需要通过进一步的临床试验验证。