TOE1通过Hippo信号通路调控肝细胞癌恶性进展的转录组学机制研究

《Scientific Reports》：Transcriptomic analysis reveals the potential role of TOE1 in hepatocellular carcinoma

　　本研究针对肝细胞癌(HCC)高复发转移及预后差的临床难题，聚焦EGR1靶基因TOE1的生物学功能。通过整合TCGA等数据库的生物信息学分析、体外细胞实验及RNA-seq技术，发现TOE1在HCC中显著高表达且与不良预后相关。机制研究表明TOE1通过调控Hippo信号通路关键分子(YAP1/TEAD)影响肿瘤细胞干性、免疫细胞浸润及化疗敏感性，为HCC的精准诊疗提供了新靶点。

　　

肝细胞癌(HCC)是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，尤其在发展中国家负担沉重。尽管近年来诊断技术有所进步，但HCC患者的五年生存率仍不理想，早期患者手术切除后五年生存率仅18%，而晚期患者对消融治疗和化疗的反应有限。高复发率和转移倾向是导致HCC预后差的主要原因，因此深入探索HCC的发病机制并寻找新的治疗靶点成为当务之急。

在这种背景下，早期生长反应因子1(EGR1)作为重要的转录因子，在肿瘤发生发展中扮演着复杂角色。然而，其靶基因TOE1(Target of EGR1)在癌症中的功能研究却十分有限。TOE1是一种属于DEDD外切酶超家族的脱腺苷酶，主要定位于核内Cajal体，参与小核RNA的成熟过程。虽然TOE1在早期胚胎发育和端粒维持中具有重要作用，但它在HCC中的具体功能和机制尚不清楚。

为了解决这一科学问题，敖杰宇、蔡毅等研究人员在《Scientific Reports》上发表了题为"Transcriptomic analysis reveals the potential role of TOE1 in hepatocellular carcinoma"的研究论文，系统探讨了TOE1在HCC发生发展中的生物学功能及分子机制。

研究人员采用多组学整合分析策略，关键技术方法包括：基于TCGA数据库的生物信息学挖掘TOE1表达与临床病理特征、预后的关联；利用TIMER、cBioPortal等平台分析免疫细胞浸润和基因组不稳定性；通过siRNA干扰技术在HepG2和Huh7细胞系中敲低TOE1表达；采用RNA-seq转录组测序筛选差异表达基因；使用CCK-8、Transwell等实验验证细胞表型变化；结合qPCR、Western blot验证关键分子表达。研究还纳入了中山大学附属第七医院提供的临床样本进行免疫组化验证。

研究结果方面，通过系统的生物信息学分析发现：

TOE1在HCC组织中显著上调表达，且与患者不良临床病理特征相关。TIMER 2.0平台分析显示，TOE1在肝细胞癌(LIHC)、胆管癌(CHOL)等多种癌症中异常高表达，而在肾嫌色细胞癌(KICH)等肿瘤中表达下调。对TCGA数据库的深入分析表明，TOE1高表达与HCC患者肿瘤T分期、个体癌症分期等临床参数显著相关。

TOE1表达与HCC患者预后显著相关。Cox比例风险模型分析显示，TOE1高表达是LIHC、GBM-LGG、LGG等多种癌症总体生存期(OS)的不良预后因素。Kaplan-Meier生存分析进一步证实，TOE1高表达的HCC患者总体生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)、无病生存期(DFS)和无进展生存期(PFS)均显著缩短。

TOE1参与肿瘤微环境(TME)免疫调节。单细胞转录组数据分析(GSE140228、GSE98638)显示TOE1在多种免疫细胞中均有表达，包括T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞等。相关性分析发现TOE1表达与B细胞、M1/M2型巨噬细胞、中性粒细胞、CD8⁺ T细胞、调节性T细胞(Tregs)等多种免疫细胞的浸润水平呈显著正相关，表明TOE1可能通过调节免疫细胞浸润影响肿瘤微环境。

TOE1表达与肿瘤干细胞特性及治疗反应相关。研究表明TOE1表达与DNA干细胞指数(DNAss)和RNA干细胞指数(RNAss)显著相关，提示其可能参与维持肿瘤干细胞特性。此外，TOE1高表达与肿瘤突变负荷(TMB)、微卫星不稳定性(MSI)等免疫治疗反应标志物呈正相关。药物敏感性分析显示TOE1高表达组对Bortezomib、Docetaxel等化疗药物更敏感。

体外实验验证了TOE1的生物学功能：

临床样本验证显示TOE1在HCC组织中蛋白水平显著升高。免疫组化分析证实HCC癌组织比癌旁正常肝组织呈现更强的TOE1染色强度。

成功建立TOE1敲低细胞模型。研究人员设计三种靶向TOE1的siRNA，在HepG2和Huh7细胞中进行转染，qPCR和Western blot验证siTOE1-2具有最佳敲低效率，TOE1 mRNA和蛋白水平均显著下降。

TOE1敲低抑制HCC细胞恶性表型。CCK-8实验显示TOE1沉默显著抑制细胞增殖；Transwell实验表明TOE1敲低后细胞迁移和侵袭能力明显减弱。

RNA-seq揭示TOE1调控的分子网络。TOE1敲低导致2，373个基因表达发生变化，其中1，137个基因表达上调，1，236个基因表达下调。差异表达基因(DEGs)主要富集于细胞周期、 autophagy(自噬)、 apoptosis(凋亡)等相关通路。

机制研究发现TOE1通过Hippo信号通路调控HCC进展。KEGG富集分析显示下调基因显著富集于Hippo signaling pathway。TOE1敲低导致YAP1、TEAD1、TEAD2等Hippo通路关键分子表达下降，Western blot验证YAP1蛋白水平显著降低。

关键分子验证确认TOE1调控网络。研究人员选取10个与癌症进展相关的差异表达基因进行验证，包括细胞周期相关基因(CDK2、CCNE1、CCND1、P21、P27^kip)、ferroptosis(铁死亡)相关基因FTH1、autophagy相关基因(ULK1、BECN1、ATG3)以及泛素化相关基因UBC。实验结果表明TOE1 positively regulates(P21、FTH1、P27^kip、BECN1、ATG3、UBC) while negatively regulating(CDK2、CCNE1、CCND1)。

研究结论与讨论部分指出，本研究首次系统阐明了TOE1在HCC中的致癌作用及其分子机制。TOE1作为EGR1的靶基因，在HCC中异常高表达并通过调控Hippo信号通路促进肿瘤恶性进展。值得注意的是，TOE1表达与肿瘤干细胞特性、免疫细胞浸润以及化疗敏感性密切相关，表明其在肿瘤微环境重塑中发挥多重作用。

特别值得关注的是，TOE1可能通过调节Hippo-YAP/TAZ信号轴影响巨噬细胞功能，这为理解TOE1在肿瘤免疫微环境中的作用提供了新视角。尽管TOE1与免疫细胞浸润的相关性系数适中，但这种广泛而一致的趋势提示TOE1可能通过转录后调控或Hippo-YAP/TAZ相关信号间接影响免疫反应。

该研究的创新性在于首次将TOE1与Hippo信号通路联系起来，并揭示了其在HCC中的多层面调控作用。TOE1不仅影响肿瘤细胞自身的增殖、侵袭能力，还通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和干细胞特性，共同促进HCC进展。这些发现为HCC的分子分型、预后评估和靶向治疗提供了新的生物标志物和治疗靶点。

当然，研究也存在一定局限性，如主要聚焦于HepG2和Huh7细胞系，缺乏其他HCC细胞系和原代细胞的验证；TOE1调控Hippo信号通路的具体分子机制仍需深入探索；TOE1作为治疗靶点的临床转化价值需要进一步验证。

总之，这项研究全面揭示了TOE1在HCC中的关键作用，证明了其通过多种分子机制影响肿瘤进展的潜力。TOE1作为一个有前景的诊断、治疗和预后评估靶点，为HCC的精准医疗提供了新的思路和方向。未来针对TOE1在不同癌种中的作用机制及其作为治疗靶点的临床价值研究，将有助于推动肿瘤精准治疗的发展。