《Bioresource Technology》：Utilizing immobilized lipase for selective esterification in non-aqueous media: A strategy to enrich and purify conjugated linoleic acid isomers
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介质硅负载假丝酵母 rugosa 脂酶的非水相两步选择性酯化工艺成功实现共轭亚油酸（CLA）异构体的高效富集，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA纯度分别达87.05%和89.83%，载脂酶的负载量为89.61±1.21 mg·g?1。
杜美君|金俊|曾伟|魏伟|张慧|金庆哲|王兴国|唐颖颖
中国江苏省无锡市江南大学食品科学与技术学院，食品科学与资源国家重点实验室，214122
摘要
Candida rugosa脂肪酶的特异性识别能力为分离共轭亚油酸（CLA）异构体提供了一种绿色方法。然而，其有限的选择性和较差的操作稳定性阻碍了其工业应用。本研究建立了一种基于介孔二氧化硅（MS）固定化脂肪酶的非水相选择性酯化新系统，实现了CLA异构体的高效富集。通过功能化MS表面并优化固定化参数，达到了89.61 ± 1.21 mg·g?1的脂肪酶负载量。随后对酯化条件的优化显著提高了固定化脂肪酶的催化效率和选择性。采用乙醇作为酰基受体，通过两步选择性酯化过程，获得了相对纯度为87.05%（回收率33.02%）的c9, t11-CLA和相对纯度为89.83%（回收率35.96%）的t10, c12-CLA。本研究提供了一种可持续且可扩展的高价值CLA异构体绿色生产方法，具有在功能性食品和营养健康产品中的潜在应用。
引言
共轭亚油酸（CLA）是一组具有共轭双键的十八二烯酸的位置和几何异构体。其中，cis-9, trans-11（c9, t11-CLA）和trans-10, cis-12（t10, c12-CLA）是主要的生物活性异构体，广泛存在于反刍动物来源的食品和商业补充剂中（Gong等人，2019年；Du等人，2024b年）。这些异构体具有抗癌、降脂、抗炎和免疫调节作用（Du等人，2025a年；Shen和McIntosh，2016年；Du等人，2024a年；Song等人，2023年）。然而，由于高纯度单一异构体的稀缺，相关机制研究受到限制。
目前，从市售CLA（1:1混合物）中靶向富集CLA异构体是最有效的方法之一。然而，由于这些异构体的物理化学性质相似，传统的分离和纯化技术（如尿素络合、低温结晶、硝酸银络合和色谱法）存在效率低下、能耗高和试剂污染的问题。相比之下，脂肪酶催化的生物催化分离提供了一种更可持续的替代方案，因为脂肪酶能够区分异构体之间的细微结构差异。先前的研究使用了游离的Candida rugosa脂肪酶（Lipase AY）与各种醇（如乙醇、月桂醇、l-薄荷醇）来富集CLA异构体（Wang等人，2007年；Kim等人，2017年；Kobayashi等人，2006年）。然而，这种油-水界面活化的脂肪酶系统受到反应平衡、脂肪酶利用率低和多步骤操作的固有限制，从而影响了总体产率和工业可行性。
脂肪酶的固定化是一种提高其催化活性、底物特异性和稳定性的经典策略。通过界面工程构建非水相反应系统可以有效规避传统水相催化中的热力学平衡限制，并显著提高生物催化剂的重复使用性。对于Lipase AY而言，固定化尤为重要，因为其活性位点被一个两亲性α-螺旋环结构所屏蔽（Barriuso等人，2016年）。先前的研究表明，通过疏水相互作用将脂肪酶分子锚定在载体表面上可以诱导构象重排，打开“盖子”暴露活性位点，从而生成更具催化活性的开放构象（界面活化机制）（Alves等人，2017年）。因此，选择具有适当疏水性的载体对于成功活化脂肪酶至关重要。在潜在的载体中，介孔二氧化硅（MS）因其高表面积、大孔体积和固有的生物相容性而被认为是理想的脂肪酶固定化载体（Guan等人，2025年）。先前的研究已经应用了固定在未修饰MS上的Lipase AY进行CLA相关反应，但这些系统并未充分利用界面活化作用，选择性有限（Yu等人，2015年）。因此，疏水修饰MS在优化脂肪酶-载体界面以提高Lipase AY对CLA异构体的选择性方面的潜力尚未被探索。
在这项研究中，我们假设将Lipase AY固定在疏水修饰的MS上可以创建有利的脂肪酶-载体界面和非水微环境，从而提高对CLA异构体的催化效率和选择性。为了验证这一假设，系统地筛选了具有不同表面修饰的MS载体，优化了固定化参数，并在各种反应系统中评估了所得生物催化剂的催化性能。进一步应用了两步选择性酯化过程从商业CLA-FFA 80混合物中富集c9, t11-CLA和t10, c12-CLA。总体而言，这项工作展示了一种基于界面工程的固定化策略，结合了疏水修饰的MS和非水介质，实现了CLA异构体的高效富集，并提高了选择性和操作稳定性。这些发现为通过载体表面疏水性和反应介质的协同设计实现高价值CLA异构体的可持续绿色生产提供了新的见解。
材料
共轭亚油酸（CLA-FFA 80）包含大约等量的c9, t11-CLA和t10, c12-CLA异构体，其他异构体的含量占总量的不到3.0%（w/w），由青岛澳海生物科技有限公司提供。Candida rugosa脂肪酶（Amano Lipase AY 400SD，400 U/mg，以下简称“Lipase AY”）由Amano Enzyme China Ltd.提供。介孔二氧化硅微球（XD-SO5J和FF-FXD）由鑫达新材料科技有限公司提供。
MS类型和表面修饰对CLA酯合成活性的影响
MS材料的结构和表面化学性质对脂肪酶负载效率和酯合成活性具有决定性影响。孔径、维度和连通性直接影响脂肪酶负载效率、构象稳定性和底物扩散速率，而Si-OH密度、疏水性和官能团通过电子效应影响脂肪酶的“界面活化”行为。图2比较了固定在MS上的脂肪酶的酯化活性
结论
本研究通过将Lipase AY固定在C18功能化的MS上，开发了一种非水相催化系统，显著提高了脂肪酶对c9, t11-CLA的催化效率、操作稳定性和选择性。固定化过程遵循化学吸附主导的机制，实现了89.61 ± 1.21 mg·g?1的负载量。在优化条件下，两步酯化处理商业CLA-FFA80实现了c9, t11-CLA和t10, c12-CLA的有效富集
CRediT作者贡献声明
杜美君：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，软件使用，方法学研究，实验设计。金俊：写作 – 审稿与编辑，项目监督，项目管理。曾伟：方法学研究，概念构思。魏伟：项目管理。张慧：资源协调，项目管理，资金筹集。金庆哲：资源协调，项目管理，资金筹集。王兴国：资源协调，项目管理，资金筹集。唐颖颖：写作 – 审稿与
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢中国国家重点研发计划（2021YFD2100303）的支持。
