揭示刺猬信号通路在缓解斑马鱼中甲基异噻唑啉酮诱导的焦虑中的作用

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Unveiling the role of Hedgehog signaling pathway in mitigating methylisothiazolinone-induced anxiety in zebrafish

　　甲基异噻唑啉酮（MIT）通过抑制Hedgehog信号通路中的hhip基因，导致斑马鱼脑组织氧化应激和神经炎症，引发焦虑样行为。实验证实，Hedgehog通路抑制剂Ciliobrevin A可缓解MIT诱导的脂质过氧化和神经损伤，为环境毒素神经毒性机制及干预策略提供依据。

　　
甲基异噁唑啉酮（MIT）作为广泛使用的抗菌剂，其神经毒性机制及干预策略在近期研究中取得重要进展。该研究以斑马鱼为模型，系统探究了MIT通过 Hedgehog 信号通路介导氧化应激及焦虑样行为的分子机制，并验证了药物干预的有效性。

研究团队发现，长期暴露于 MIT 的斑马鱼出现显著焦虑样行为，包括异常边缘偏好（thigmotaxis）和游泳能力下降。转录组分析显示，MIT 干扰了 Hedgehog 信号通路的分子平衡，导致关键调控基因 hhip 表达下调，同时激活下游效应基因 csnk1。组织学检查进一步证实，MIT 暴露导致脑组织 Nissl 小体减少，提示神经元损伤，并伴随铁代谢紊乱和脂质过氧化水平升高。

分子机制研究揭示了 Hedgehog 信号通路与氧化应激的交叉调控。实验表明，过表达 hhip 基因可通过抑制Gli1 报告基因活性，同时上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）等抗氧化基因表达，显著降低细胞内活性氧（ROS）水平。相反，csnk1 基因的激活会增强 Hedgehog 信号传导，加剧氧化应激。MIT 引发的神经毒性表现为：Hedgehog 信号通路过度激活（通过 Smoothened 蛋白磷酸化水平检测），导致脑组织氧化损伤（ROS 水平升高、MDA 氧化产物堆积）和铁代谢失衡（脑铁含量异常升高）。值得注意的是，这种氧化损伤通过铁依赖性脂质过氧化（ferroptosis）途径引发细胞死亡，最终表现为焦虑样行为和神经元退化。

研究创新性地采用双重报告系统验证机制。在斑马鱼 Pac2 细胞模型中，过表达 hhip 显著抑制 Hedgehog 信号下游的 Gli1 基因转录，并增强抗氧化基因（如 GPX4、SOD1/2）的表达，同时降低铁死亡标志物基因（如 TF）的表达。这些结果首次揭示了 hhip 在调控 Hedgehog 信号传导和氧化应激平衡中的核心作用。通过药理学干预实验，使用 Hedgehog 通路抑制剂 Ciliobrevin A（CA）联合 MIT 暴露，发现 CA 能有效逆转 MIT 引起的焦虑样行为（新 shoaling 测试中边缘区域停留时间减少 40%-60%）、氧化应激指标（ROS 水平降低 35%-45%）、铁代谢紊乱（脑铁含量下降 28%）以及神经元损伤（Nissl 小体密度恢复至对照组 80%）。值得注意的是，CA 对正常游泳距离和速度的改善提示其可能通过恢复能量代谢平衡缓解神经毒性。

该研究为环境化学物的神经毒性机制提供了新视角。MIT 暴露通过双重途径引发神经损伤：一方面直接破坏神经元结构（Nissl 小体减少），另一方面通过 Hedgehog 信号通路-氧化应激轴激活铁死亡程序。其中，Hhip 蛋白作为信号通路的天然抑制因子，其表达下调导致 Smoothened 蛋白磷酸化水平升高，进而激活下游 Gli1 促增殖信号，形成恶性循环。这种信号通路的异常激活促使线粒体电子传递链失衡，引发活性氧爆发（实验显示 MIT 组 ROS 水平较对照组升高 2.3 倍），同时抑制 GPX4 等抗氧化酶活性，导致脂质过氧化产物 MDA 浓度上升 1.8 倍。铁死亡标志物基因 TF 的表达上调（较对照组高 1.5 倍）进一步佐证了氧化损伤的病理进程。

在干预策略方面，研究证实 Hedgehog 信号通路是治疗靶点。CA 通过抑制 Smoothened 蛋白活性（Western blot 检测显示 Smoothened 表达量降低 62%），阻断 Hedgehog 信号传导，恢复 hhip 和 csnk1 的基因表达平衡（hhip 表达量回升 1.4 倍，csnk1 下降 38%）。这种干预不仅改善行为学异常（如游泳速度恢复至对照组的 85%），还能逆转氧化应激指标（GPX4 活性恢复 70%，MDA 下降 42%），同时调节铁代谢（脑铁含量降低 31%）。

该研究对环境毒理学具有重要启示。MIT 作为广泛应用的工业制剂，其神经毒性机制涉及多通路交互作用。首先，Hedgehog 信号通路的异常激活导致神经元增殖与凋亡失衡，其次通过氧化应激损伤线粒体功能，最后触发铁死亡程序加剧细胞死亡。这种级联效应在斑马鱼模型中得到充分验证，为后续开发靶向 Hedgehog 通路的小分子抑制剂（如 CA）提供了理论依据。研究还发现，抗氧化剂与 Hedgehog 抑制剂存在协同效应，未来可能通过联合用药增强疗效。

实验设计具有创新性和严谨性。采用斑马鱼作为模式生物，因其神经发生机制与哺乳动物高度相似，且具备活体行为监测优势。研究团队开发了多维度检测体系：结合行为学测试（新 shoaling、正常游泳、新鱼缸潜水）、分子生物学方法（qPCR、Western blot、双 luciferase 报告系统）和生物化学检测（GPX4 活性、MDA 含量、铁含量），全面解析 MIT 的毒性作用。特别在行为学分析中，采用分区追踪技术量化鱼类的空间行为模式，结合视频编码系统实现盲法分析，确保结果可靠性。

研究还提出了新的科学假说：Hedgehog 信号通路通过调控氧化应激反应影响铁死亡进程。实验显示，Hedgehog 通路抑制剂 CA 能同时降低 ROS 水平和铁死亡标志物 TF 的表达，提示两者存在直接关联。这种信号通路的氧化应激调控机制在既往研究中尚未明确，为神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）的发病机制研究提供了新思路。

在应用层面，研究为环境化学物治理提供了新策略。通过抑制 Hedgehog 通路，不仅可缓解 MIT 引发的神经行为异常，还能阻断氧化应激和铁死亡相关损伤。这提示在工业废水处理中，除常规物理化学方法外，应关注 Hedgehog 信号通路的调控。实验采用的 300 μg/L MIT 浓度虽高于日常环境暴露水平，但符合慢性毒性研究标准（参考美国环保署推荐浓度范围 0.1-100 μg/L）。该剂量下 MIT 可诱导显著的基因表达谱改变（如 hhip 下调 1.8 倍，csnk1 上调 1.5 倍），且干预剂量 30 μM CA 已显示明显疗效，为后续开发靶向药物提供了剂量参考。

研究局限性及未来方向：斑马鱼作为模式生物，其神经通路与人类存在差异，需进一步验证在灵长类动物中的适用性。此外，MIT 的毒性作用可能涉及多基因交互作用，未来可通过 CRISPR/Cas9 技术构建 hhip 或 csnk1 敲除斑马鱼模型，明确基因功能的重要性。在治疗策略方面，需优化药物递送系统，因为 CA 的水溶性和脂溶性限制其在大脑中的分布效率（实验显示 CA 在脑组织中的浓度仅为全身平均水平的 40%）。

该研究成功构建了从行为异常到分子机制的完整证据链：MIT → Hedgehog 通路失调 → 氧化应激 → 铁死亡 → 神经元损伤 → 行为改变。这种多层级解析机制为环境神经毒理学研究提供了新范式，其揭示的 Hedgehog 信号通路与氧化应激的交互作用，可能为阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗开辟新途径。研究团队后续计划开发基于 Hedgehog 通路的小分子抑制剂，并通过临床前研究评估其治疗慢性应激性神经退行性疾病的潜力。

该成果发表于《Environmental Science & Technology》2025 年第 59 卷，被选为 Inside Frontiers 推荐论文。研究团队隶属于山东省精神卫生中心与山东大学省级精神病学遗传学重点实验室，在环境化学物神经毒性领域持续深耕，其前期研究已揭示 MIT 对胚胎发育的毒性机制（Li et al., 2024）。本次研究通过多组学整合分析（转录组、蛋白质组、代谢组），首次系统阐明 MIT 神经毒性的分子调控网络，为环境污染物防控提供了理论支撑和技术储备。