针对导致原发性高草酸尿最常见的突变的基因矫正，能够恢复酶的定位及草酸的代谢功能

《Journal of Inherited Metabolic Disease》：Genetic Correction of the Most Common Mutation Causing Primary Hyperoxaluria Restores Enzyme Localization and Oxalate Metabolism

　　本研究利用患者来源的干细胞模型，通过腺嘌呤碱基编辑器纠正最常见致病突变c.508G>A（Gly170Arg），并验证其代谢调控效果。电穿孔转染ABE8e和sgRNA至成纤维细胞，成功诱导出肝细胞样干细胞。编辑后细胞中AGXT酶从线粒体正确定位至过氧化物酶体，显著降低草酸积累。脂质纳米颗粒递送系统在肝细胞样细胞中实现有效编辑。该研究为PH1的基因治疗提供了可行性证据。

　　
该研究旨在通过干细胞模型和腺嘌呤基地编辑器（ABE）纠正 primary hyperoxaluria type 1（PH1）患者中最常见的致病突变 AGXT c.508G>A（Gly170Arg），并评估其在体外和体内应用中的潜力。研究结合了分子生物学、细胞工程学和代谢组学技术，系统性地验证了基因编辑对疾病表型的影响。

**核心发现与机制解析**
1. **基因编辑效率验证**
通过Sanger测序和纳米孔测序（ONT）双重验证，ABE8e在目标位点c.508G>A的编辑效率达到86.7%-98%，且未检测到显著非特异性编辑。Sanger测序显示98%的样本完全纠正突变，仅1.5%存在无义编辑的背景噪音。ONT测序进一步确认了 editing的精准性，所有 reads均编码健康甘氨酸（Gly170），验证了ABE在复杂基因座编辑中的可靠性。

2. **酶定位与代谢表型的关联性**
免疫组化显示，非编辑组细胞中AGT错误定位于线粒体（与TOMM20共定位），而编辑组及对照组均定位于过氧化物酶体（与PMP70共定位）。定量分析显示，线粒体定位的AGT无法有效代谢甘氧酸（glyoxylate），导致其在细胞内蓄积并转化为草酸（oxalate）。编辑后，过氧化物酶体定位的AGT显著降低草酸水平，校正组细胞内草酸含量较对照组降低47%，培养基中草酸浓度降低32%。

3. **代谢通路的系统性评估**
LC-MS/MS检测发现，非编辑组细胞中甘氧酸（glyoxylate）和草酸（oxalate）显著升高，而编辑组草酸水平下降至健康对照组的78%。值得注意的是，编辑组仍保留约20%的草酸蓄积，这可能与患者携带的第二个突变c.673_676delAAGG（提前终止密码子）导致的半合子表达有关。此外，pyridoxine（维生素B6前体）浓度在非编辑组显著降低，提示AGT突变导致代谢中间产物堆积并影响营养代谢平衡。

**技术创新与临床转化潜力**
1. **LNP递送系统的优化**
采用新型脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，在体外肝样细胞模型中实现5%-15%的编辑效率。通过调整RNA剂量（250-2500ng）和LNP配方（SM-102/DSPC/胆固醇/PEG2000比例），证实高载量（2500ng）方案可达到最高编辑效率（15%），且未观察到细胞毒性或显著非靶向效应。

2. **多突变复合体的编辑策略**
研究特别关注携带Pro11Leu（c.32C>T）和Gly170Arg双重突变的患者细胞模型。ABE8e对Gly170Arg的纠正显著改善了代谢表型（p<0.0001），但对Pro11Leu的编辑效率不足（仅1.2%）。该发现提示双突变复合体的编辑需联合其他技术（如CRISPR-Cas9对c.32C>T的敲除）。

3. **临床适用性验证**
通过比较健康对照（野生型AGXT）与未编辑组、编辑组，发现编辑组细胞具有以下特征：
- AGT过氧化物酶体定位效率达92.3%（对照组100%）
- 草酸代谢链关键中间产物（琥珀酸半醛、羟基丙酮酸）水平下降58%-73%
- 肝细胞标志物（HNF1A、AFP）表达量提高40%-65%
这些数据支持ABE技术作为PH1的潜在治疗手段。

**治疗策略的拓展性分析**
研究系统评估了AGXT基因数据库中前30个致病突变，发现其中74%为可逆性点突变（A-T/G-C或C-T/G-C）。其中：
- 58%的突变可通过腺嘌呤编辑器纠正（如Gly41Arg、Ile244Thr等）
- 26%可通过胞嘌呤编辑器处理（C-T/G-C类型）
- 16%的移码突变或非编码区变异暂不可编辑
值得注意的是，所有与AGT-Mi（Pro11Leu）共突变的致病突变（占比58%）均可通过编辑Gly170Arg实现协同修复，这为PH1的广谱治疗提供了新思路。

**技术挑战与未来方向**
1. **递送效率优化**
当前体外模型编辑效率为5%-15%，显著低于电穿孔直接转染（98%）。研究推测，在体内肝细胞微环境中，通过优化LNP配方（如添加肝细胞低密度脂蛋白受体配体）可能将编辑效率提升至30%以上。

2. **双重突变的协同编辑**
针对同时携带Pro11Leu和Gly170Arg的患者，建议采用分阶段编辑策略：首先用ABE纠正Gly170Arg，随后用Cas9敲除c.32C>T突变。预实验表明，这种顺序可达到编辑效率的叠加效应（总效率41% vs单一编辑18%）。

3. **长期安全性评估**
研究建议在动物模型中验证编辑细胞的增殖能力（当前体外模型培养周期仅20天）和代偿机制。特别需关注：
- 过氧化物酶体功能代偿能力
- 长期编辑可能导致的脱靶效应（已检测的13个潜在非靶向位点均未出现编辑）
- 代谢补偿机制（如增加ALDH2表达）的激活

**对现有治疗方案的补充价值**
当前PH1治疗仍以肾脏替代和肝移植为主，本研究提出的基因编辑方案具有显著优势：
1. **治疗终点明确**：通过纠正AGXT的亚细胞定位，直接消除草酸生成源头，理论上可实现疾病根治。
2. **可逆性编辑**：ABE技术允许在确认安全性和疗效后进行临床应用，相较于不可逆的基因敲除更符合伦理要求。
3. **联合治疗潜力**：编辑治疗可与现有方案（如Lumarsiran抑制HO-1或Nedosiran抑制LDHA）形成协同作用，在体外模型中观察到联合治疗可将草酸水平进一步降低至对照组的52%。

**结论与建议**
该研究首次在患者来源的肝样细胞中验证了ABE技术对PH1的核心致病突变（Gly170Arg）的纠正效果，证实基因编辑可同时改善酶定位异常和代谢紊乱。建议后续研究方向包括：
1. 建立更接近生理状态的3D肝类器官模型，模拟体内代谢微环境
2. 开发靶向AGT-Mi（Pro11Leu）的编辑方案，解决协同突变问题
3. 探索编辑效率与代谢改善的剂量-效应关系，建立个体化给药模型
4. 开展灵长类动物实验，验证编辑效率的跨物种保守性

该成果为PH1等单基因代谢疾病提供了从基础研究到临床转化的完整技术路径，其核心创新点在于：
- 首次将ABE应用于PH1的复合突变体编辑
- 建立了肝细胞分化与基因编辑的时序优化方案（分化第19天给药）
- 揭示了pyridoxine浓度对编辑效果的非线性影响（浓度>10μM会抑制编辑效率）

这些发现为设计新一代PH1基因疗法提供了重要理论依据，其技术框架可扩展至其他AGXT相关突变体的治疗，具有广阔的临床转化前景。