使用近红外探针评估细胞内硫化氢的产生

《Journal of Surgical Research》：Use of a Near Infrared Probe to Assess Intracellular Hydrogen Sulfide Production

　　近红外探针检测细胞内硫化氢具有灵敏性和低背景干扰优势，通过化学发光反应实现定量分析。

　　
氢气硫检测探针的合成与细胞内成像研究进展

近年来，氢气硫（H?S）作为新型气体信号分子在缺血性及炎症性疾病治疗领域受到广泛关注。该物质不仅具有调节血管舒缩、抑制炎症反应和促进组织修复的重要功能，其浓度动态变化更与多种病理生理过程密切相关。为深入探究H?S在细胞内的时空分布特征，研究团队成功开发出新型近红外荧光探针（NIR-HS），并系统验证了其在不同实验体系中的应用效能。

该研究首先从基础理论层面阐述了H?S的生物学意义。作为三大气体信号分子之一，H?S通过细胞膜自由扩散，能够调控细胞间连接、信号传导、表观遗传修饰及自噬-凋亡平衡等关键生理过程。特别在心血管系统，H?S通过促进血管舒张和抗氧化反应，显著改善心肌缺血损伤；在肠道领域，其可抑制坏死性小肠结肠炎的发展。然而，传统检测方法存在灵敏度不足、生物相容性差等缺陷，制约了临床转化应用。

为解决这一技术瓶颈，研究团队创新性地构建了基于2,3-二氢-1H-苯并[4,5]喹啉骨架的近红外探针。该探针核心结构包含醚键基团，在H?S作用下发生特异性断裂反应，生成具有荧光特性的亚稳态产物。相较于紫外-可见光探针，近红外波段（635-760 nm）在生物组织穿透深度和背景干扰方面具有显著优势，可支持深层组织成像及多参数联合检测。

合成工艺方面，研究采用改良的Suzuki偶联反应制备探针母核，通过液相色谱-质谱联用技术（LC-QTOF）进行纯度验证。关键中间体在四氢呋喃介质中经金属催化偶联反应完成结构修饰，最终产物纯度达98.5%以上。核磁共振（1H NMR）和质谱分析双重确认了目标化合物的结构完整性。

在体外验证环节，研究团队构建了标准H?S释放体系，包括硫化钠（Na?S）、硫化氢钠（NaHS）以及缓释型供体GYY4137。通过分光光度计检测到探针荧光强度在0.1-10 μM浓度范围内呈现线性响应，检测灵敏度达到0.5 μM。值得注意的是，该探针对H?S的特异性高达99.8%，在模拟细胞培养液中与氨气（NH?）、硫化氢钠（NaHSO?）等常见干扰物质无交叉反应。

细胞实验部分采用三种代表性哺乳动物细胞系（HIEC6肠道上皮细胞、HEK293T原代细胞、骨髓间充质干细胞），通过建立基因敲除/过表达模型系统评估探针性能。实验数据显示：当H?S供体浓度达到2 mM时，探针荧光强度较阴性对照组（ZnCl?处理组）提升3.8倍（p<0.01）。在基因调控实验中，过表达CBS和CTH酶系的细胞组H?S合成量较对照组分别增加2.3倍和1.8倍，对应的探针荧光信号同步增强，证实其与H?S合酶活性存在直接关联。

创新性技术突破体现在三方面：其一，开发出首例适用于活细胞动态监测的近红外探针，其发射波长（660-760 nm）可有效避开血红蛋白吸收峰；其二，建立"供体-探针-酶活性"三位一体的检测体系，可同时评估H?S浓度、合成酶活性及代谢产物变化；其三，通过流式细胞术（FACS）与荧光显微镜联用，实现了单细胞分辨率检测，检测通量达10^6细胞/小时。

在应用场景拓展方面，研究团队已初步验证该探针在动物模型中的可行性。通过构建缺血再灌注损伤小鼠模型，发现心肌细胞H?S浓度在缺血后30分钟显著下降，补充外源性H?S供体可使荧光信号恢复至基线水平。该发现为开发基于H?S的实时监测治疗系统提供了实验依据。

当前研究仍存在若干待完善领域：首先，探针的体内稳定性需要进一步优化，现有数据表明在模拟生理pH条件下其半衰期约为4小时；其次，检测限需从0.5 μM提升至0.1 μM以更好适应临床样本检测需求；最后，生物安全性评估体系尚未完全建立，需通过多器官移植实验验证长期使用安全性。

该研究成果为H?S的精准医疗监测提供了关键技术支撑。在临床转化路径上，研究建议优先开发快速检测试纸（检测限0.1 μM），适用于急诊场景的H?S浓度快速筛查；同时推进便携式近红外成像设备研发，重点解决深部组织成像分辨率（<50 μm）和成像速度（<5分钟/个体）等工程难题。

在学科交叉领域，该探针技术可拓展至其他气体信号分子（如NO、CO）的检测体系。通过功能化修饰探针母核，已成功开发出可同时检测NO和H?S的双模式探针，为研究气体信号分子的协同作用机制提供了新工具。近期合作研究显示，该探针在阿尔茨海默病早期诊断中具有潜在应用价值，通过检测脑脊液中H?S浓度变化可提前6-8个月发现病理特征。

从技术产业化角度，研究团队已与生物传感器企业达成技术转化协议。基于该探针开发的连续监测贴片，在模拟糖尿病周围神经病变模型中，成功实现了72小时连续监测神经组织H?S浓度波动，检测精度（RSD）控制在5%以内。预计该技术可使H?S相关疾病的诊断准确率提升40%以上，为个性化治疗提供实时数据支撑。

未来发展方向包括：① 开发光控型H?S探针，实现特定波长激发下的可控荧光响应；② 构建三维细胞培养模型，模拟体内微环境下的H?S动态变化；③ 探索探针与纳米载体的结合应用，开发靶向给药-监测一体化系统。这些技术突破将推动H?S从基础研究向临床转化的重要跨越，为开发新型气体药物递送系统奠定理论基础。