局部表面声波触发的内皮细胞中的剂量依赖性钙响应及其时空特性

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Dose-dependent calcium response and its spatiotemporal characteristics in endothelial cells triggered by localized surface acoustic waves

　　本研究开发了一种SAW-integrated微流控平台，用于原位细胞培养、局部超声刺激和实时钙成像。在HUVECs中发现，脉冲SAW刺激能引起累积剂量依赖的钙响应，证实了机械振动独立于空化或剪切应力直接触发了钙信号。细胞间钙波通过间隙连接传播，表明超声波可协调组织级响应。

　　

朱志豪|丁素玉|桑大川|苏华金|涂娟|张东|郭夏生

现代声学国家重点实验室（教育部），南京大学物理学院，先进微结构协同创新中心，中国南京210093

摘要

超声波刺激通过钙依赖性过程调节细胞活性，但其机械转导机制仍因多种物理效应的相互依赖而变得复杂。为了研究超声波触发的钙响应特性和细胞间钙波的机制，我们开发了一种集成表面声波（SAW）的微流控平台，该平台支持原位细胞培养、局部刺激和实时钙成像。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，局部脉冲SAW刺激引发了可重复的、剂量依赖性的钙响应，并具有不同的功率阈值，这些通过群体水平的统计分析得到量化。细胞间钙波通过缝隙连接在声学孔径外传播，证实了组织尺度的协调性。单独的机械振动也能直接引发钙瞬变，这与空化或剪切应力无关，这一点通过基于凝胶的隔离实验得到了验证。

引言

超声波（US）刺激已成为调节细胞过程的多功能工具，其生物效应包括从神经元激活到组织再生[1]，[2]。这些效应的核心是细胞内钙（Ca²⁺）瞬变，它们通过机械转导途径介导即时响应（例如，一氧化氮释放）和持续适应（例如，机械适应性基因表达）[3]，[4]。然而，超声波触发的Ca²⁺信号的空间和时间动态，特别是其启动机制和传播特性，仍不甚清楚，这限制了基于超声波的疗法的合理设计[3]。

空化是广泛研究的超声波生物效应机制之一，它通过微泡振荡引起的微流和射流形成产生剪切应力[5]，[6]。虽然空化能够激活机械敏感通道（例如，Piezo1）或通过膜穿孔促进钙内流[7]，但其生物学相关性受到生理和技术限制。大多数细胞存在于组织中，而不是悬浮在流体中，这使得空化产生的力无法直接应用。即使在暴露于流体的内皮细胞中，血液等生物流体的高粘度也会抑制声流[8]，进一步降低了空化的实用性。这些限制还伴随着内在的安全挑战：过量的声能传递可能导致不可逆的膜损伤和病理去极化，即使在优化的体外系统中也是如此[9]，[10]。

除了安全问题外，超声波诱导的物理效应（例如，空化、声流和声辐射力）之间的相互依赖性也使得机制清晰度受到影响。在Ca²⁺信号动态方面，尤其是剂量依赖性和时空协调性方面，仍存在持续的知识空白，这阻碍了临床转化，参数优化和副作用缓解的关键问题仍未解决[11]。新兴的高频模式，如表面声波（SAWs），通过实现无微泡的机械调节，为研究超声波触发钙响应的特性和机制提供了新的途径。基于SAW的研究已经证明了在无微泡条件下多样的超声波生物效应，包括在内皮[12]和神经元细胞[13]中的钙信号激活，以及增殖增强[14]等表型变化。然而，振动介导的Ca²⁺瞬变与功能结果之间的联系仍然不明确。

鉴于血管系统在生理调节中的普遍存在，理解内皮细胞如何将超声波刺激转化为钙信号具有广泛的治疗意义。在血管内皮中，超声波诱导的Ca²⁺波通过缝隙连接传播，以协调组织尺度的响应[12]，这一过程对血管稳态至关重要。然而，仍有两个基本问题尚未解决：（1）单独的声振动是否直接启动Ca²⁺信号；（2）空间受限的刺激如何产生扩展的细胞间响应。解决这些空白需要将振动效应与复杂的流体介导机制区分开来。

我们开发了一种集成SAW的微流控（声流控）平台，以实现局部超声波刺激、实时钙成像和通过凝胶超声处理抑制声流。使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行了实验，系统地量化了剂量依赖性的激活阈值和钙波的时空传播动态。研究表明，内在的声振动可以直接激活钙信号，与空化或剪切应力无关。这些发现为血管疗法中的超声波参数优化提供了范例，在这种疗法中，可以避免与空化相关的细胞损伤，同时实现精确的机械调节——这是朝着更安全的声基因学应用迈出的重要一步。

实验设置

实验装置

图1所示的集成SAW的微流控平台包括三个子系统：局部刺激、环境控制和机械生物学分析。聚焦SAWs（FSAWs）通过图案化在LiNbO₃基板上的聚焦指间换能器（F-IDTs）产生，并通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道传播，见图1(a)。图1(b)所示的观察区域被划分为三个感兴趣的区域（ROIs），靠近声源的区域（150 × $75$

场特性分析

使用已建立的声-结构相互作用方法[15]进行了三维有限元模拟，以量化基板表面的垂直位移幅度，见图2(a)。各向异性的基板使光束聚焦到一个延长的焦区内，在轴向（$y$）传播过程中保持横向稳定性。固液界面的横向位移剖面（图2(c)，红色虚线部分）显示出一个主要瓣，其幅度为$150\mu m$

声学效应的机制分离

连续的单脉冲刺激（PL=50 ms；功率： dBm）被用来探究分级FSAW暴露的效果（图10(a),(b)）。刺激时机与先前脉冲的荧光平台期同步，成像集中在刺激后的钙峰值。最初的25 dBm脉冲迅速激活了近端ROI（在10秒时达到峰值），而中央ROI的反应则较为稀疏。在25.5 dBm时，远端ROI的细胞表现出意外的激活优势

结论

本研究展示了高频聚焦表面声波（FSAWs）在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中引发的实时钙响应，以及脉冲超声波刺激下的钙波传播。我们发现，累积的脉冲超声波剂量可以调节启动钙响应所需的阈值功率，而阈值后的钙升高幅度不受影响。此外，缝隙连接介导的钙波

作者贡献声明

朱志豪：撰写——原始草稿，可视化，方法学，研究，概念化。丁素玉：撰写——原始草稿，可视化，研究，数据管理。桑大川：可视化，软件。苏华金：验证，正式分析。涂娟：撰写——审稿与编辑，资源获取。张东：资源获取，资金筹集。郭夏生：撰写——审稿与编辑，资源管理，项目协调，资金筹集，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：82427901和12374437）的支持。张东和郭夏生是南京医科大学心血管疾病转化医学协同创新中心的成员。

朱志豪于2020年在中国南京大学获得物理学学士学位。他目前是中国南京大学物理学院的博士生，研究方向为微流控和超声波生物效应。