《Vaccine》：A novel alphavirus-based saRNA platform for enhanced vaccination efficacy and organ-specific targeting
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基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的自扩增RNA（saRNA）通过优化帽结构、核苷酸修饰、多聚腺苷酸尾长度和调控元件，实现了超过10倍的蛋白表达提升。体外筛选出 Everglades 病毒（EVEV）、Mosso das Pedras 病毒（MDPV）和 Rio Negro 病毒（RNV）三种saRNA候选株，联合SM102脂质纳米颗粒递送系统进行体内评价，发现优化saRNA具有持续表达、免疫原性可控及脾脏靶向富集特性，为多跨膜抗原靶向递送提供了新策略。
孙震|刘玉晓|张浩毅|葛婷|潘玉婷|刘洋|吴淼淼|单涛|朱国强|吴琦|陈康明
基因斯克（GenScript）mRNA与质粒部门，中国江苏省南京市
摘要
自扩增RNA（saRNA）源自α病毒，编码非结构蛋白（NSP1–4），这些蛋白能形成复制酶复合体，从而在比传统mRNA更低的剂量下实现长时间和高效的蛋白质表达。然而，由于其高免疫原性和有限的复制效率，需要对其进行优化以提升蛋白质表达效果。在本研究中，我们通过改进其帽结构、核苷酸修饰、polyA尾长度和调控元件，系统性地优化了一种基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的saRNA，使其蛋白质表达水平比野生型提高了10倍以上。此外，我们在体外筛选了28种α病毒来源的saRNA构建体，最终选择了三种表现最佳的候选者：沼泽地病毒（EVEV）、Mosso das Pedras病毒（MDPV）和Rio Negro病毒（RNV），并使用SM102脂质纳米颗粒（LNP）制剂和荧光素酶报告基因进行了体内评估。这些优化后的saRNA表现出持续的表达能力、更强的但可耐受的免疫原性、独特的肝外组织特异性分布，以及显著更高的脾脏靶向性。这一新型saRNA平台已成功用于针对难处理的多跨膜抗原hCCR9和小鼠TSCOT的抗体开发。小鼠和兔子的体内免疫实验表明，基于EVEV的saRNA诱导的免疫反应比线性mRNA更强且更一致。这种器官特异性表达模式为靶向RNA治疗提供了新策略，进一步结合先进的递送技术可提升基于mRNA的治疗的精准度、疗效和治疗潜力。
引言
近年来，mRNA技术的快速发展显著重塑了现代制药科学，与传统治疗方法相比，它提供了简化的生产流程、高效的纯化方法和更好的可扩展性[[1], [2], [3]]。然而，传统mRNA的不稳定性、快速降解和短半衰期仍然是关键挑战，这推动了RNA设计和递送策略的优化[[4], [5], [6], [7]]。在这些新型RNA方法中，源自正链α病毒的自扩增RNA（以下简称saRNA）是一个有前景的平台。通常，saRNA编码病毒非结构蛋白（NSP1–4），这些蛋白能形成依赖RNA的RNA聚合酶复合体，从而在相对较低的剂量下实现持续扩增和长时间蛋白质表达[[8], [9], [10], [11], [12]]。最近，基于saRNA的COVID-19疫苗ARCT-154在日本（2023年）和欧盟（2025年）获得批准，凸显了其临床相关性和潜力[[13,14]]。然而，saRNA的复制过程会生成双链RNA中间体，激活宿主的先天免疫途径（如RIG-I/MDA5和PKR），从而抑制翻译效率并降低目标蛋白表达[[15], [16], [17]]。
为了在最小化不必要的免疫激活的同时优化saRNA的疗效，研究人员采用了多种方法，包括序列优化、共表达免疫调节蛋白以及选择免疫原性较低的复制子变体[[15],[18],[19],[20],[21]]。例如，Sahin等人成功利用共递送免疫逃逸蛋白（E3/K3/B18）来抑制体内免疫反应，显著提高了saRNA的表达[[22]]。同样，Li等人通过体外进化方法筛选出具有增强蛋白质表达和较低免疫刺激性的委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）突变复制子[[23]]。
除了这些优化方法外，α病毒本身也是提升saRNA性能的宝贵来源，因为它们具有天然的多样性和组织特异性嗜性。α病毒包含超过30种不同的亚型，其中一些亚型已被广泛研究，如Semliki Forest病毒（SFV）、Sindbis病毒（SINV）、东方马脑炎病毒（EEEV）和VEEV[[24]]。这些病毒对特定组织具有天然的嗜性——VEEV主要感染神经元和淋巴组织，SINV靶向肌肉和皮肤细胞，而基孔肯雅病毒（CHIKV）则对成纤维细胞和关节组织有亲和力[[25],[26],[27]]。基于这些病毒的自然嗜性，可以推测来自不同α病毒的saRNA也可能具有独特的器官特异性表达模式。目前，mRNA治疗的靶向递送主要依赖于脂质纳米颗粒（LNP）制剂的改良，如脂质筛选或配体结合[[28],[29],[30]]。然而，利用α病毒来源的saRNA的天然嗜性可能提供一种替代且互补的靶向RNA递送策略。
因此，本研究旨在优化saRNA载体的设计，并系统地筛选α病毒来源的saRNA构建体，以识别具有增强表达效率和理想组织特异性表达模式的序列。首先，我们对基于VEEV的saRNA构建体进行了优化，得到了一个蛋白质表达显著提高（比野生型高10倍以上）的变体。随后，构建了一个包含30种不同α病毒来源saRNA载体的文库，并在体外进行了筛选。表现最佳的saRNA在体内进一步进行了评估，使用荧光素酶报告基因系统来表征其生物分布和组织嗜性。结果表明，选定的saRNA表现出持续的蛋白质表达和独特的器官特异性分布，为靶向RNA治疗提供了一种新方法。将这些优化的saRNA载体与先进的递送技术结合，可能进一步提升基于mRNA的药物的精准度、疗效和治疗潜力。
基于VEEV的saRNA设计全面优化
尽管基于VEEV的saRNA载体在mRNA药物开发中得到了广泛应用，但仍需进一步优化以提升蛋白质表达并降低免疫原性。在本研究中，我们使用表达eGFP的构建体对VEEV saRNA载体进行了优化，系统地测试了不同的亚基因组RNA 5'非翻译区（UTR）、共因子、帽结构类似物和poly(A)尾长度，以改善其性能。
在传统的saRNA设计中，目标基因的开放阅读框（ORF）通常直接位于亚基因组（subgenomic）启动子之后。
讨论
基于VEEV的saRNA载体在RNA治疗研究中得到广泛应用，目前的优化工作主要集中在突变非结构蛋白和共表达免疫抑制蛋白上，以提升其性能[[9,19,39,40]]。在本研究中，我们通过评估帽结构、polyA尾长度、亚基因组5'非翻译区序列、m5C修饰以及免疫抑制蛋白（IPP）候选物等关键成分，系统地优化了saRNA的设计。
质粒和菌株
saRNA的设计是通过将VEEV（TC-83菌株）的结构蛋白序列替换为编码eGFP蛋白的基因来实现的。该构建体在5'端包含一个mini T7启动子，在3'端包含一个70 bp的poly A尾，以及一个Bsp QI切割位点。对于含有亚基因组5'非翻译区的载体，在亚基因组启动子和EGFP序列之间插入了不同的UTR序列。设计用于共表达免疫抑制蛋白的载体将这些蛋白与eGFP序列连接起来。
CRediT作者贡献声明
孙震：撰写原始稿件、验证、项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。
刘玉晓：撰写原始稿件、验证、项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析。
张浩毅：验证、项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析。
葛婷：验证、项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析。
潘玉婷：
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益和个人关系：陈康明、孙震、刘玉晓、张浩毅、葛婷、潘玉婷、刘洋拥有南京基因斯克生物科技有限公司（Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.）申请的专利#PCT/CN2025/074563。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
