《Veterinary Microbiology》：Highly virulent
Aerococcus viridans activates the RIPK3 signaling pathway, inducing necroptosis and inflammation in bovine mammary epithelial cells and murine mammary tissue
编辑推荐：
研究通过体外（牛乳腺上皮细胞）和体内（小鼠乳腺腺体）模型，比较了有毒和无毒Aerococcus viridans菌株的致病机制。发现有毒菌株激活RIPK3-MLKL坏死途径，导致细胞膜破裂、炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6大量释放，并引发乳腺组织严重损伤和炎症细胞浸润。RIPK3抑制剂GSK872可有效减轻炎症和损伤。该研究首次阐明A. viridans通过激活RIPK3依赖性坏死通路引发乳腺炎的分子机制，为开发靶向坏死通路的新型疗法提供了理论基础。
孟思宇|徐茂林|邓茜|朱子萌|赫尔曼·W·布拉克玛|约翰·P·卡斯特利奇|爱德华多·R·科博|韩波|刘刚
中国农业大学兽医学院临床兽医系兽医公共卫生与安全国家重点实验室，北京100193，中华人民共和国
摘要
Aerococcus viridans（A. viridans）是一种广泛存在于环境中的条件性致病细菌，近年来在牛乳腺炎中的检出率逐渐增加；然而，其致病机制仍不清楚。坏死性凋亡（necroptosis）是一种与牛乳腺炎相关的程序性细胞死亡形式。本研究旨在阐明毒力较强的A. viridans在两种感染模型（体外（牛乳腺上皮细胞）和体内（小鼠乳腺）中引发急性感染的分子机制。与无毒株相比，毒力较强的A. viridans可显著增加晚期凋亡/坏死乳腺上皮细胞（bMECs）的数量，同时伴随乳酸脱氢酶（LDH）释放的增加以及IL-1β、TNF-α和IL-6分泌的显著升高。此外，高毒力株能够激活RIPK3并使MLKL发生磷酸化，而无毒株则无法激活这一途径。此外，高毒力株在体内还会导致严重的乳腺组织损伤和炎症细胞浸润，表现为腺泡广泛破坏以及乳腺组织中p-RIPK3和p-MLKL的高表达，这些结果与体外实验结果一致。在两种感染模型中，特定的RIPK3抑制剂（GSK872）均显著减轻了炎症和组织损伤，减少了细胞因子的释放，并下调了高毒力株诱导的RIPK3-MLKL信号通路。我们得出结论，高毒力A. viridans引发乳腺炎的分子机制是通过激活RIPK3依赖的坏死性凋亡途径实现的，这为开发新的治疗策略提供了理论基础。
引言
Aerococcus viridans（A. viridans）是一种革兰氏阳性球杆菌（常被误认为是链球菌），在血液琼脂上可产生α-溶血现象（Liu等人，2015年），在环境中广泛存在（Ezechukwu等人，2019年）。该细菌可引起人类的尿路感染、菌血症、心内膜炎和脑膜炎（Rasmussen，2016年；Ezechukwu等人，2019年），以及鱼类和甲壳类动物的致命感染（Clark和Greenwood，2011a；Wu等人，2024年），还可能引起猪的流产（Nguyen等人，2021年）。此外，A. viridans作为乳腺炎的原因也越来越受到关注（Saishu等人，2015年），已成为中国大规模奶牛场的主要病原体（Sun等人，2017年；Song等人，2020年）。感染A. viridans的奶牛表现出体细胞计数（SCC）升高、产奶量下降以及乳汁成分改变（Sun等人，2017年）。
在龙虾中，A. viridans的不同亚型具有不同的毒力（Clark和Greenwood，2011a）。我们之前的研究表明，一种具有强黏附性和侵袭性的A. viridans毒力株在体外可损伤牛乳腺上皮细胞（bMECs），表现为细胞膜裂解、线粒体肿胀和细胞器解体；此外，这种菌株在体内可引发小鼠的急性乳腺炎（Liu等人，2019年）。
坏死性凋亡是一种由肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其受体（TNFR1）或其他细胞受体（如死亡受体、Toll样受体和胞质核酸传感器）激活引起的程序性细胞死亡形式。这一过程由受体相互作用蛋白激酶1和3（RIPK1/3）介导，它们会磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL），促进坏死小泡的形成。这些小泡转移到细胞膜内侧，破坏细胞膜的完整性并引发坏死性凋亡，这是一种依赖于RIPK3的细胞死亡方式（Bertheloot等人，2021年）。与凋亡不同，坏死性凋亡会导致细胞内容物释放到细胞外环境中，从而引发强烈的炎症反应（Pasparakis和Vandenabeele，2015年）。
牛乳腺上皮细胞（bMECs）是乳腺和血乳屏障结构的主要免疫屏障和第一道防线。越来越多的证据表明，致病细菌可以通过在乳腺组织中诱导坏死性凋亡途径来破坏这一保护机制，这在牛乳腺炎模型中得到了证实（Xia等人，2023年）。然而，A. viridans（尤其是高毒力株）引发乳腺炎的具体机制仍不清楚。本研究旨在阐明毒力较强的A. viridans在两种感染模型（体外（bMECs）和体内（小鼠乳腺）中引发急性乳腺炎的分子机制。
伦理声明
本研究已获得中国农业大学兽医学院伦理委员会的批准（协议编号SYXK，2016-0008），并遵循该校制定的标准伦理指南进行。
细菌菌株
关于毒力较强和无毒力A. viridans菌株的详细信息已有所描述（Liu等人，2019年）。菌株保存在中国农业大学兽医学院的乳腺炎诊断实验室。每次实验前，都会使用新鲜的细菌
毒力较强的A. viridans诱导bMECs发生坏死
将毒力较强和无毒力的A. viridans以5:1的比例与bMECs共培养12小时。与对照组相比，无论是毒力较强还是无毒力的菌株感染组，Annexin V-FITC和PI阳性细胞的数量均显著增加。值得注意的是，毒力较强菌株导致的晚期凋亡/坏死细胞数量显著增加（P < 0.01）（见图1A-B），同时IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌也显著增加（P < 0.001）
讨论
坏死性凋亡是一种保守的细胞死亡机制，与动物多种疾病的发展密切相关，包括炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和退行性疾病（Weinlich等人，2017年）。病原体介导的坏死性凋亡信号通路已成为一种关键的致病策略，许多细菌利用受体相互作用蛋白（RIP）激酶级联反应来破坏宿主防御机制。例如肺炎链球菌和粘质沙雷菌
结论
在本研究中，一种毒力较强的A. viridans菌株激活了RIPK3-MLKL坏死性凋亡途径，导致细胞死亡和炎症；而无毒力菌株则未能激活这一途径，造成的损伤较小。因此，本研究揭示了一种在日益重要的乳腺炎病因中的新型坏死性凋亡机制。相比之下，大多数乳腺炎病原体主要通过caspase依赖的凋亡途径发挥作用。此外，GSK872能够保护乳腺上皮细胞
出版同意
所有作者均已阅读手稿，并同意以当前形式提交该手稿以供本期刊考虑发表。
资助
本研究由中国国家自然科学基金（项目编号32202878）和高端外国专家引进计划（项目编号H20240556）资助。
作者贡献声明
刘刚构思并设计了实验。孟思宇、徐茂林、邓茜和朱子萌负责实验监督、研究实施及手稿撰写。徐茂林、赫尔曼·W·布拉克玛、爱德华多·R·科博、约翰·P·卡斯特利奇、刘刚和韩波协助数据分析并修订了手稿。刘刚和韩波还对手稿进行了最终审阅并提供资金支持。
作者贡献声明
刘刚：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、方法学研究、资金申请、数据管理、概念构建。赫尔曼·W·布拉克玛：撰写——审稿与编辑、资源获取、数据分析。约翰·P·卡斯特利奇：撰写——审稿与编辑、资源提供、数据分析。爱德华多·R·科博：撰写——审稿与编辑、数据可视化、结果验证。韩波：撰写——审稿与编辑、实验监督、资金申请、数据分析。孟思宇：撰写
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
