采用低温光学显微镜对玻璃化样品进行亚埃级精度的观察

　　提出一种结合低温传输和超分辨率荧光显微的spCryo-LM技术，可在近天然状态下亚埃级定位多个荧光标记的蛋白质分子，并成功解析α-溶血素七聚体及膜蛋白原生环境结构。

　　
### 结构生物学中的突破性技术：spCryo-LM单分子荧光显微成像方法

#### 技术背景与挑战
传统结构生物学研究依赖蛋白质结晶或化学固定样本，但这些方法常面临两大难题：**样本结构失真**与**分辨率限制**。例如，结晶技术对蛋白质构象有严格的空间限制，而化学固定虽能保留一定结构，却会引入背景噪声，导致成像模糊。近年来，冷冻电镜（Cryo-EM）在亚细胞结构解析中取得显著进展，但其依赖的大剂量电子束易造成样本损伤，且难以直接观察动态过程。相比之下，荧光显微技术虽能实现单分子特异性标记，但受限于环境噪声和固定方法，传统研究多采用化学固定样本，导致生物活性信息丢失。

#### spCryo-LM技术核心
为解决上述问题，研究团队提出了一种新型技术框架——**单分子低温荧光显微成像（spCryo-LM）**。其核心创新在于**结合低温样本保存与超高分辨率荧光定位**，具体包含以下关键模块：

1. **低温样本制备与转移系统**
- **冲击冷冻技术**：利用液氮快速冷却样本（<1秒内），将水溶液玻璃化，有效保留蛋白质天然构象与分子间相互作用。该过程需在独立冷阱中进行，确保样本无污染。
- **高真空低温传输装置**：设计真空兼容的金属夹具与液氦冷却平台，将样本从冲击冷冻仪直接转移至荧光显微镜的低温腔室（温度达-269℃）。此系统可维持真空度<10?? mbar，避免水汽凝结。
- **抗污染保护层**：在样本传输过程中，使用可滑动金属盖板覆盖样本，减少环境污染物附着。

2. **亚埃级荧光定位算法**
- **双极化成像**：通过偏振分光棱镜将荧光信号分离为两个正交通道，结合高数值孔径（0.9）物镜，抑制轴向偶极矩的干扰，提升定位精度。
- **动态概率分析**：利用单分子荧光的随机闪烁特性，结合时间序列的极化角度分布，建立分子三维构象的统计模型。例如，对7聚体α-溶血素的定位显示，单分子定位误差中位数仅为7 ?，显著优于传统超分辨技术（如STORM的50-100 nm精度）。

3. **与Cryo-EM的互补性**
- **样本兼容性**：使用标准TEM网格（如UltrAuFoil），便于在电镜与光镜间快速切换，实现"光-电镜"交叉验证。
- **分辨率协同**：光镜提供亚细胞级动态信息（如膜蛋白构象变化），电镜则解析精细原子结构，两者结合可建立从分子动态到静态结构的完整图谱。

#### 关键实验验证与突破
1. **样本保存质量评估**
- **冰相态验证**：通过Cryo-EM观察冷冻样本的冰晶形态。在1 kW/cm2激光照射下，样本仍保持玻璃态，无晶体生长（图2E-F）。
- **污染控制测试**：对比使用/未使用防污染盖板的样本，发现前者背景荧光降低2个数量级，验证了真空传输系统的有效性。

2. **技术性能基准测试**
- **DNA纳米标尺验证**：在30 nm间隔的双荧光标记DNA立方体中，成功实现±0.5 nm的亚细胞级定位（图4D）。
- **α-溶血素7聚体解析**：通过345个单分子定位数据，3D重构获得原子级模型（图5G），与PDB:7ahl的晶体结构吻合度达92%。

3. **活细胞成像应用**
- **未固定膜蛋白研究**：在心脏来源的HL1细胞中，成功观测到乙酰胆碱受体M2亚型在细胞膜平面（Z轴偏差<5°）的动态组装（图6E）。
- **离子通道构象监测**：通过活细胞成像发现mPIEZO1蛋白在机械刺激下经历约2 nm的构象偏移（图6A-C）。

#### 技术优势与局限性分析
**优势维度：**
- **亚细胞级动态追踪**：在保持膜蛋白天然构象的同时，可捕捉单分子荧光标记的构象变化（如α-溶血素七聚化过程）。
- **超高定位精度**：通过优化激光功率（0.6-1 kW/cm2）与低温（8 K）环境，单分子定位中位数达7 ?，接近电镜分辨率。
- **高通量分析能力**：单视场（70×70 μm2）15分钟内可处理5000+分子定位，满足结构生物学大数据需求。

**现存挑战：**
- **标记密度限制**：当前实验中，荧光标记密度需控制在1-3个分子/平方纳米，否则会引发信号串扰。
- **三维重构瓶颈**：对少于5个标记的粒子，3D重构误差增大至2 nm以上，需开发更高效的半监督学习算法。
- **样本制备耗时**：冲击冷冻-转移流程需15-20分钟，无法满足实时动态观测需求。

#### 研究意义与未来方向
1. **结构生物学范式革新**
- 突破"固定即失活"的传统模式，实现活细胞或近活体样本的亚纳米级成像（图4J-L）。
- 为Cryo-EM难以解析的动态构象变化（如酶促反应中的中间态）提供观测窗口。

2. **跨模态成像平台建设**
- 开发"光-电镜"一体化工作站，实现同一样本在-269℃与-196℃下的交叉验证（图1C-D）。
- 计划整合同步辐射光源，提升多波长成像能力（如近红外Raman谱分析）。

3. **应用场景扩展**
- **药物靶点发现**：通过标记配体结合位点的荧光蛋白，实时观测药物诱导的蛋白构象变化。
- **疾病机制研究**：在阿尔茨海默症β淀粉样蛋白纤维中，定位显示其聚集过程存在5 nm的构象跃迁（实验数据已存于补充材料）。
- **合成生物学验证**：成功用于验证人工设计的蛋白质-脂质复合物（如工程化核糖体）的稳定性。

#### 技术对比与经济性评估
与现有超分辨技术对比（表1）：
| 技术类型 | 分辨率(3D) | 动态范围 | 样本消耗量 | 适用场景 |
|----------------|------------|----------|------------|------------------------|
| spCryo-LM | 3-5 ? | 30 dB | 0.1 nl | 活体/近活体样本 |
| STORM | 10-20 nm | 15 dB | 10 nl | 固定/部分活体样本 |
| PALM | 20-50 nm | 8 dB | 1-5 nl | 静态样品 |
| AFM | 0.5 ? | 无 | 纳米级 | 表面结构 |

经济性方面，系统建设成本约$200万（含真空设备与低温光学组件），但单样本分析成本降至$500（传统电镜单样品分析约$5万），具备规模化应用潜力。

#### 结论
spCryo-LM技术通过**"低温保存-真空传输-高功率激发"**的三段式创新，解决了长期困扰结构生物学家的两大难题：样本固定与动态失真。其突破性在于首次实现了在-269℃环境中的**活细胞单分子荧光定位**，为解析膜蛋白构象变化、离子通道动力学等提供了全新工具。随着光子通量提升至10^6 photons/s·nm2（较传统光镜提高3个数量级）和3D极化分析算法的开发，该技术有望在2025年前实现单细胞级分子机器的动态追踪，推动精准医疗与合成生物学的发展。