温度对鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）皮肤胶原蛋白的影响：结构、乳化性能及流变特性

《Food Chemistry: X》：Effect of temperature on bighead carp ( Hypophthalmichthys nobilis) skin collagen: Structure, emulsification and rheological properties

　　本研究制备了大头鱼皮肤胶原蛋白（SC），通过圆二色光谱、红外光谱和X射线衍射分析温度对其三螺旋结构及次级结构的影响，发现温度低于热变性温度（Td=31.1℃）时，SC的β-折叠和随机卷曲比例增加，乳化活性指数（EAI）达161.83 m2/g，表现出优异的乳化稳定性和剪切稀化特性，适用于食品和化妆品领域。

　　
大口黑鲈皮肤胶原蛋白的结构特性及其热处理效应研究

（摘要部分）
该研究以大口黑鲈皮肤为原料，通过酸提法制备了具有典型三螺旋结构的I型胶原蛋白（SC）。通过圆二色光谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合X射线衍射（XRD）技术，系统揭示了SC在不同温度下的三维结构演变规律。实验表明，SC的热变性温度（Td）为31.1℃，在此温度以下，其三螺旋结构占比保持较高水平，且分子内氢键网络完整。温度超过Td后，胶原蛋白发生不可逆的热变性，三螺旋结构占比骤降至24.11%，并伴随β-折叠向无规卷曲的构象转变。这种结构变化显著影响了SC的乳化活性指数（EAI）和流变学特性，在30℃时EAI达到峰值161.83 m2/g，表现出优异的乳化稳定性能。研究还发现，温度升高导致溶液粘弹性降低，特别是当温度接近Td时，材料从剪切稀化流体转变为非牛顿流体特性，这为胶原蛋白基生物材料的工业化加工提供了理论依据。

（引言部分）
胶原蛋白作为一类天然高分子材料，因其优异的生物相容性和可加工性，在食品添加剂、化妆品原料和医用材料领域具有重要应用价值。相较于陆地动物来源的胶原蛋白，鱼类胶原蛋白具有更低的致敏风险和宗教禁忌限制，且其分子量更易被人体吸收。据市场预测，全球鱼类胶原蛋白市场规模将在2032年达到11.23亿美元，但目前仍存在原料供应不足的问题。大口黑鲈作为中国四大养殖鱼类之一，2024年产量已达3.487万吨，其皮肤作为废弃副产物可规模化提取胶原蛋白。本研究通过系统分析温度对大口黑鲈皮肤胶原蛋白的结构-性能关系，旨在为开发新型胶原蛋白基生物材料提供科学依据。

（材料与方法部分）
实验采用酸提法从大口黑鲈皮肤中提取胶原蛋白，具体流程包括：原料预处理（4℃水洗去除杂质）、酸提（0.5M醋酸12小时浸提）、离心纯化（9000rpm×30分钟）、盐析（5% NaCl沉淀）、透析脱盐（0.1M醋酸→去离子水梯度透析），最后冷冻干燥保存。结构表征采用三联技术：
1. **SDS-PAGE电泳**：验证胶原蛋白纯度，α1和α2链分子量分别为129kDa和122kDa，电泳纯度达95.08%
2. **FTIR光谱**：通过二阶导数结合高斯拟合分析，确认存在典型胶原蛋白特征峰（酰胺I峰1655cm?1，酰胺II峰1540cm?1）
3. **XRD衍射**：计算得到晶面间距d=11.59?（Bragg方程），证实保留天然三螺旋结构

热稳定性测试采用MCR302流变仪，通过旋转模式测定不同温度（10-60℃）下溶液的粘弹性变化。乳化性能测试参照Li等（2022）方法，制备油包水乳液并测定乳化活性指数（EAI）和稳定性指数（ESI）。

（研究结果部分）
1. **结构特性**
- XRD证实SC保留典型三螺旋结构的特征衍射峰（7.62°和20.06°）
- FTIR分析显示初始α-螺旋占比43.8%，β-折叠31.4%，β-转角24.8%
- 热变性温度Td=31.1℃，此时三螺旋结构占比降至24.11%，无规卷曲占比达36.43%

2. **热处理效应**
- **低温阶段（ - **临界温度（Td）**：三螺旋结构完全解体，形成以无规卷曲（36.43%）和β-转角（24.81%）为主的新构象
- **高温阶段（>Td）**：持续热处理导致分子量下降，溶液粘弹性显著降低

3. **性能表征**
- **乳化性能**：30℃时EAI达到峰值161.83 m2/g，较牛骨胶原（14.26-58.12）和羊皮胶原（69.6）具有显著优势。超过Td后EAI骤降至32.84 m2/g
- **流变特性**：全温度范围内均呈现剪切稀化特性（n<1），但流动行为随温度变化呈现梯度差异：
* 低温（20-30℃）：典型伪塑性流体，n值0.0338-0.4908
* 中温（30-40℃）：粘弹性显著降低，n值突降至0.0338
* 高温（>40℃）：溶液呈现非牛顿流体特性，粘弹性参数波动较大

4. **构象-性能关系**
- β-折叠占比与EAI呈正相关（r=0.82），其含量的增加（25℃时达45.78%）显著提升界面膜形成能力
- 无规卷曲占比超过α-螺旋时（30℃），乳化活性达到峰值，但超过临界温度后溶液稳定性急剧下降
- 热处理导致胶原蛋白分子间氢键断裂，Ostwald-De Weale模型参数k值从8.71 Pa·s?降至0.3476 Pa·s?

（讨论部分）
本研究发现大口黑鲈皮肤胶原蛋白具有独特的温度依赖性结构转变特征：
1. **热稳定性对比**：SC的Td（31.1℃）显著高于其他鱼类胶原蛋白（如三文鱼皮肤胶原Td=12.01℃），可能与黑鲈的高温养殖环境相关，其胶原蛋白链间形成更紧密的氢键网络
2. **构象转变机制**：温度升高导致β-折叠通过分子内氢键解聚，同时促进β-转角和无规卷曲的形成。这种转变在30℃时达到临界点，此时无规卷曲占比达33.51%，形成多孔结构增强乳化能力
3. **流变学应用潜力**：在20-30℃区间，SC溶液表现出优异的可加工性，其n值（0.4105-0.5791）和粘度（2.05-32.9 Pa·s）参数可满足注射成型（n<0.5）和3D打印（n≈0.5）工艺要求
4. **工业化建议**：建议加工温度控制在25-30℃区间，既能保持较高的乳化活性（EAI>150 m2/g），又可维持溶液的剪切稀化特性（n<0.4）

（结论部分）
本研究证实大口黑鲈皮肤胶原蛋白具有温度响应式性能特征：在热变性温度以下，其独特的β-折叠/无规卷曲共轭结构赋予材料优异的乳化稳定性和可加工性。通过精确控制加工温度（推荐25-30℃），可实现以下应用优化：
- **食品工业**：作为天然乳化剂，在常温储存条件下保持EAI>140 m2/g
- **化妆品领域**：作为成膜剂在pH 5-7环境下可形成稳定薄膜（ESI>300 min）
- **生物医药**：注射用溶液在30℃时粘度仅3.26 Pa·s，满足微创注射要求

研究同时揭示了胶原蛋白构象转变的量化关系：当β-折叠占比超过40%时，材料具有最佳乳化性能；而当无规卷曲占比超过35%时，流变学特性更适合3D打印等加工工艺。这些发现为开发新型胶原蛋白基材料提供了重要的结构-性能调控策略，特别是为从废弃鱼皮中提取高附加值生物材料开辟了新途径。

（补充说明）
该研究创新性地将流变学与结构生物学相结合，通过构象分析指导材料性能优化。特别值得注意的是，在30℃处理后的SC溶液不仅保持最高乳化活性，其流变学参数（n=0.4908，k=3.26 Pa·s?）还适合注射成型（n<0.5）和薄膜制备（n≈0.5）两种极端应用场景，这为胶原蛋白的多功能应用提供了理论支持。同时，发现SC在低温下（20℃）的ESI值达到372.97 min，这为开发常温稳定的胶原蛋白基乳液提供了技术储备。