在丹参（Salvia miltiorrhiza）中，通过对钙依赖性激酶CPK基因家族的全基因组鉴定发现，SmCPK24能够促进丹参酮类化合物的生物合成

《Industrial Crops and Products》：Genome-wide identification of the calcium-dependent kinase CPK gene family in Salvia miltiorrhiza reveals that SmCPK24 promotes tanshinone biosynthesis

　　紫草中25个CPK基因被鉴定，SmCPK24通过磷酸化SmWRKY1增强DXS2转录，促进紫杉醇合成，揭示钙信号调控次生代谢的新机制。

　　
本研究以药用植物丹参（*Salvia miltiorrhiza*）为对象，系统解析了钙信号调控网络在次生代谢中的功能机制。通过基因组学筛选鉴定出25个钙依赖蛋白激酶（CPKs）基因，并首次发现SmCPK24通过磷酸化WRKY转录因子SmWRKY1，显著促进丹参酮生物合成这一核心结论。研究揭示了植物中钙信号与代谢途径的分子互作网络，为药用植物代谢工程提供了新靶点。

一、研究背景与科学问题
丹参作为传统名贵中药材，其活性成分丹参酮的合成涉及复杂的次生代谢通路。已有研究证实WRKY转录因子家族通过调控关键酶基因（如DXS2、CPS1等）影响丹参酮积累（Cao et al., 2018；Deng et al., 2019），但上游信号转导机制仍不清楚。CPKs作为钙信号核心组分，在植物逆境响应和代谢调控中发挥关键作用，但其在丹参次生代谢中的具体功能尚未明确。本研究通过多组学整合和蛋白质互作分析，首次建立"钙信号-激酶-转录因子"三级调控模块，揭示了CPKs参与代谢调控的新机制。

二、核心发现与创新点
1. **CPK家族功能分化**：通过比较基因组学鉴定到25个SmCPK基因，其中SmCPK24在根部特异性表达显著（上调4.3倍），且在ABA处理后表达量达峰值（诱导倍数4.78）。结构分析显示其包含EF-hand钙结合域和蛋白激酶结构域，具备双重信号感知能力。

2. **钙非依赖性激活机制**：SmCPK24表现出独特的激活特性：在5μM Ca2?浓度下达到最大自磷酸化活性，且在无钙条件下仍保持基础磷酸化能力。这种特性使其能在环境胁迫（如干旱、盐碱）等非典型钙信号场景下启动代谢响应。

3. **激酶-转录因子互作网络**：
- 首次发现SmCPK24与SmWRKY1的相互作用：通过GST-pull down、Co-IP及Y1H酵母双杂交实验证实二者直接结合
- 功能验证显示：SmCPK24通过磷酸化SmWRKY1增强其DNA结合活性，使SmDXS2转录效率提升13.12倍
- 构建代谢调控图谱：该激酶-转录因子模块可同时调控MVA和MEP代谢途径中7个关键酶基因的表达（图9模型）

4. **代谢工程应用潜力**：
- 过表达SmCPK24使丹参酮总含量提升47%-53%（图5B）
- 特异性增强TIIA（丹参酮IIA）含量达6.53倍，为最高活性成分
- 表观遗传学分析显示调控区域存在ABA响应元件（图S2B）

三、方法论创新
1. **多尺度验证体系**：
- 基因组学：利用HMM模型和CDD数据库双重验证CPK结构域
- 蛋白组学：Phos-tag SDS-PAGE结合WB分析磷酸化状态
- 表观组学：Y1H结合EMSA定位DNA结合位点
- 代谢组学：LC-MS定量分析6种丹参酮成分

2. **时空特异性研究**：
- 采用根系定向表达系统（hairy roots）进行代谢调控研究
- 通过RNA-seq分析发现SmCPK24在根中表达量是茎叶的3.2倍
- 动态监测显示其激活滞后效应（峰值出现在ABA处理后8小时）

四、理论突破与实践价值
1. **信号转导机制新见解**：
- 首次揭示CPKs可直接磷酸化WRKY转录因子，形成"信号感知-蛋白磷酸化-基因激活"级联反应
- 发现SmCPK24独特的钙非依赖性激活模式，突破传统CPKs研究框架

2. **代谢调控网络重构**：
- 建立包含18个调控节点的CPK介导代谢网络
- 确认SmCPK24调控网络包含：ABA信号→Ca2?信号→CPK激活→WRKY磷酸化→DXS2转录→单萜合成酶激活→丹参酮组装
- 揭示MVA和MEP双途径协同调控机制（图6）

3. **应用转化潜力**：
- 开发双元表达系统（GFP标记激酶+YFP标记受体）实现可视化互作（图7）
- 建立基因编辑植株库（已获得6个稳定过表达和3个有效抑制系）
- 代谢流分析显示该模块可使丹参酮前体（DPPE）转化效率提升至78.6%（较对照提高3.2倍）

五、研究展望
1. **机制深化方向**：
- 解析SmCPK24磷酸化SmWRKY1的具体位点（计划开展磷酸化位点富集分析）
- 探究该激酶-转录因子模块与其他信号通路（如MAPK、SA信号）的交叉调控

2. **技术平台升级**：
- 开发基于CRISPR-Cas9的动态调控系统（已申请专利）
- 构建SmCPK24过表达/敲除的突变体株系（已获得3个T1代植株）

3. **产业转化路径**：
- 建立丹参次生代谢物合成酶基因簇（包含12个关键酶基因）
- 开发基于SmCPK24-SmWRKY1模块的代谢工程载体（已通过载体安全审查）
- 完成田间试验验证（已完成2年田间稳定性测试）

本研究为解析植物钙信号代谢调控提供了新的理论框架，所发现的CPK-WRKY协同调控机制已申请国家发明专利（专利号：CN2025XXXXXX.X），相关技术规程正在制定中。研究成果已应用于丹参种质改良（使丹参酮含量提升至0.38%以上，超过道地药材标准15%），相关产品进入中试阶段。