评估决定二肽中脯氨酸顺反异构化的能量效应

　　cis-trans异构平衡中Pro的顺式稳定效应及其作用机制研究。采用MD、PMF和QM计算结合IQA能量分解方法，系统研究了Ac-Z-NHMe、Ac-Gln-Z-NHMe、Ac-Leu-Z-NHMe和Leu-Z（Z=Ala/Pro）等短肽的异构稳定性。结果表明Ala→Pro取代使所有模型肽的ΔG_cis→trans绝对值降低0.4-1.1 kcal/mol，且溶剂化效应（ΔE_solv）对Pro顺式稳定贡献达1.3 kcal/mol。IQA分析显示电子效应（n→π*超共轭）贡献-3.7 kcal/mol，静电作用（ΔE_elec）为-8.9 kcal/mol，而立体效应（ΔE_ST）在Ac-Tyr-Pro-NHMe中尤为显著（-5.3 kcal/mol）。分子动力学轨迹分析表明Pro的顺式异构稳定由溶剂化作用主导，同时涉及电子超共轭和立体效应的协同作用。本研究首次通过IQA方法量化了短肽异构平衡中各因素的贡献权重，为理解复杂生物分子中的Pro异构提供了理论依据。

　　
这篇研究聚焦于短肽中丙氨酸（Pro）和脯氨酸（Ala）在顺式（cis）和反式（trans）异构体平衡中的作用机制。通过结合分子动力学（MD）、自由能计算（PMF）和量子力学（QM）方法，系统性地揭示了影响异构体稳定性的多种因素，包括溶剂效应、电子效应和立体效应的协同作用。

### 研究背景与目的
蛋白质中脯氨酸的环状结构限制其旋转自由度，使其成为影响肽链折叠的关键氨基酸。尽管已有研究指出脯氨酸倾向于稳定顺式构型，但具体机制仍存在争议。本研究通过多尺度计算，旨在量化不同因素（如溶剂化、电子超共轭效应、立体排斥）对异构体平衡的贡献，并探讨其在生物大分子（如无序蛋白）中的潜在意义。

### 实验方法
1. **分子动力学模拟**
使用 Amber force field 模拟 capped 短肽（如 Ac-X-NHMe，X=Pro/Ala）和 zwitterionic 短肽（如 Leu-Pro/Leu-Ala）的构象动力学。通过调整周期性边界条件，模拟溶剂环境（OPC 水模型），确保计算覆盖足够长的时间（500 ns）和空间（15 ? 范围）。

2. **自由能计算（PMF）**
采用伞形采样法（US）研究二面角ω对自由能的影响，将PMF周期分为120个3°间隔的窗口，通过反向蒙特卡洛平均消除历史依赖性，最终获得ΔG_cis→trans的稳定能差。

3. **量子力学计算与能量分解（IQA）**
在HF-D3/VTZ和SMD溶剂模型下，计算100个MD快照的平均QM能量。通过Interacting Quantum Atoms（IQA）方法将能量分解为：
- **量子部分**（动能+交换-关联能）：捕捉电子离域效应。
- **静电部分**：通过原子电荷密度梯度计算静电相互作用。
- **色散部分**：使用Grimme D3模型计算非极性相互作用。
- **溶剂化部分**：结合PCM和SMD模型，区分溶剂排斥和极性溶剂的静电作用。

### 主要结果
1. **顺式稳定效应**
在所有 capped 短肽中，Pro 替代 Ala 使 cis 构型稳定约0.4-1.1 kcal/mol（ΔG值降低）。例如：
- Ac-Pro-NHMe：ΔG_cis→trans = -1.4 ± 0.2 kcal/mol（PMF）。
- Ac-Tyr-Pro-NHMe：PMF 计算显示 trans 比 cis 稳定2.0 kcal/mol，但QM能量表明两者接近等能（ΔE=0.1 ±0.3 kcal/mol），可能与 Tyr 的芳香环与 Pro 的 CδH2 原子形成非极性相互作用有关。

2. **溶剂化效应的关键作用**
- 溶剂化能（ΔE_solv）在 Pro 含量系统中显著为正（1.3-2.5 kcal/mol），表明极性溶剂更稳定 cis 构型。例如，Ac-Pro-NHMe 的 cis 构型因溶剂化作用额外稳定约1.3 kcal/mol。
- 电偶极矩变化（Δμ）显示 cis 构型更极性（Δμ>0），与溶剂介电常数增强的相互作用一致。

3. **电子与立体效应的竞争**
- **超共轭效应（n→π*）**：在反式构型中，酰胺氧的孤对电子通过超共轭作用与相邻羰基π轨道共轭，贡献约-1.0至-3.7 kcal/mol的稳定能。Pro 的环状结构增强这一效应。
- **立体排斥**：通过BCP（键临界点）分析发现，cis 构型中Pro的CδH2与X残基的CαH形成更多非极性接触（如 CH···HC），而 trans 构型中这些接触减少。但IQA变形能（E_ST）显示，Ala 替换 Pro 后的立体排斥减少（ΔE_ST=-6.1 kcal/mol），与实验观察的Ala更易形成trans构型一致。

4. **序列依赖性**
- 在Ac-Gln-Pro-NHMe中，Gln的极性侧链通过静电相互作用（C=O···H-N）稳定 trans 构型，导致ΔG_cis→trans= -1.6 ±0.3 kcal/mol，低于纯Pro系统的稳定能。
- 对于 Tyr 含量系统，其芳香环与 Pro 的 CδH2形成C(π)···HC相互作用（ΔE_int,xc=-2.2 kcal/mol），这种通过空间而非电荷的相互作用在cis构型中更常见。

### 讨论与意义
1. **Pro顺式效应的多因素成因**
研究表明，Pro顺式效应并非单一因素主导，而是溶剂化、电子超共轭和立体效应的协同结果：
- **溶剂化主导**：SMD模型显示，cis构型的极性表面（如酰胺氧）与溶剂形成更多氢键（ΔE_solv>1 kcal/mol），而trans构型的疏水CδH2区域暴露于溶剂中，导致溶剂化能降低。
- **电子效应补充**：n→π*超共轭在trans构型中贡献约-2.0 kcal/mol，但溶剂化效应（+1.3 kcal/mol）抵消了部分负面影响，最终Pro系统的ΔE_cis→trans仍为负值。
- **立体效应的局限性**：BCP分析显示，cis构型中CαH与Pro的CδH2接触频率更高，但IQA变形能（E_ST）显示，其他原子（如Ac端羰基氧）的贡献更大，表明立体排斥仅是次要因素。

2. **与实验的对比**
- **Ac-Pro-NHMe**：QM计算的ΔE=0.1 kcal/mol与实验NMR测量的0.57 kcal/mol接近，验证计算模型的可靠性。
- **Leu-Pro**：zwitterionic系统中，-COO?···H3N+盐桥在cis构型中稳定作用（ΔE_solv=-29.4 kcal/mol），而Ala系统因侧链极性较低，溶剂化贡献较小（ΔE_solv=-10.0 kcal/mol）。

3. **对无序蛋白研究的启示**
- 短肽中的Pro顺式效应可能被长肽中的其他残基通过“远程立体效应”抑制。例如，实验发现多脯氨酸链（Pro)n在非极性溶剂中更易形成all-cis PPI结构，而在极性溶剂中all-trans PPII螺旋更稳定。
- 溶剂效应在长肽中可能通过“溶剂笼”效应放大，导致局部极性区域的异构体偏好性增强。

### 局限性与未来方向
1. **计算模型的简化**
当前研究未考虑溶剂分子动力学（如溶剂重组），可能低估极性残基的溶剂化能。后续研究可结合TIP3P溶剂模型进行更精确的SMD计算。

2. **多尺度模型的整合**
需要将QM计算结果与分子动力学中的长程相互作用（如氢键动态）结合，以区分溶剂-溶质和溶质-溶质相互作用。

3. **生物系统的复杂性**
在天然蛋白质中，Pro的顺式偏好可能被其他残基（如带电的Arg或Gln）通过离子键或π-π堆积修正。例如，在病毒蛋白中，Pro的顺式结构常与Trp或Tyr的芳香环形成超分子相互作用。

### 结论
本研究通过多尺度计算揭示了Pro顺式效应的分子机制：溶剂化作用（贡献约+1.3-2.5 kcal/mol）是稳定cis构型的主要因素，电子超共轭效应（约-2.0 kcal/mol）和立体排斥（约-0.6-1.0 kcal/mol）共同调节其稳定性。这一发现为解释病毒蛋白（如新冠病毒的Pro rich区域）的构象多样性提供了理论依据，并为设计靶向溶剂的药物提供了新思路。