硼二肽中的α-氨基硼酸基团能够调节蛋白酶体亚基的选择性，并有助于合成具有强抗癌和抗炎活性的化合物

　　本研究通过新型α-氨基硼酸合成方法制备了12种P1位点修饰的二肽硼酸衍生物，系统评估了其对cCP和iCP蛋白酶亚基的选择性抑制特征。结果显示，不同P1取代基显著影响亚基抑制谱，如5b-5d对β1i/β5i亚基高选择性抑制，5h对β5c/β5i具有优势抑制，而5l（P1-环戊基）虽未增强抗癌活性，但抗炎效果与Zetomipzomib相当。实验证实结构修饰可优化亚基选择性，为开发靶向蛋白酶体亚基的药物奠定基础。

　　
### 研究背景与意义
蛋白酶体作为细胞内蛋白质降解的核心酶系，在癌症、炎症和自身免疫疾病中发挥关键作用。传统蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米）虽已获批用于临床，但存在选择性不足、毒副作用显著（如周围神经病变）等问题。近年来，通过靶向蛋白酶体亚基（如β5i或β1i）的设计，有望开发出更具选择性和更低毒性的新型抑制剂。然而，现有研究多聚焦于优化P2和P3位点的侧链，而P1位点的结构多样性探索仍存在空白。本研究基于α-氨基硼酸酯的合成技术，系统地合成了12种新型P1-修饰的硼二肽化合物，并评估其亚基选择性抑制活性、细胞毒性和抗炎潜力，为下一代蛋白酶体靶向药物的开发提供了新思路。

### 研究方法与合成策略
研究团队采用一种创新的合成方法，以钾酰三氟硼酸酯（KATs）为起始原料，通过催化氢化与不对称还原步骤，高效制备了系列α-氨基硼酸酯中间体。随后，利用固相多肽合成技术，将这些中间体与P2（苯甲酰基）和P3（吡嗪-2-羧酸）固定连接，形成具有可变P1侧链的硼二肽化合物（图1）。合成过程中通过核磁共振（NMR）和质谱（MS）严格筛选产物纯度，并利用柱色谱进一步纯化。特别值得关注的是，通过调节P1侧链的电子性质、极性和空间位阻，实现了对蛋白酶体不同亚基的差异化抑制。

### 关键发现与结果分析
#### 1. **亚基选择性抑制的多样性**
通过评估化合物对cCP（构成型蛋白酶体）和iCP（免疫蛋白酶体）六种催化亚基（β1c/i、β2c/i、β5c/i）的抑制活性（IC50值），发现P1侧链的化学性质对亚基选择性具有决定性影响：
- **芳香族P1侧链**（如苯基、对甲苯基、对氟苯基）：倾向于抑制β1i和β5i亚基，其抑制强度与侧链的电子效应和疏水性相关。例如，对氯苯基取代的化合物5d对β1i的抑制活性提升50倍（IC50=17 nM），而对β5i的抑制活性达到3 nM，显示更强的β5i偏好性。
- **体积较大的环状结构**（如双苯环、苯基并环）：可能通过空间位阻增强对β5i的亲和力。例如，化合物5h（P1为双苯环）对β5c和β5i的抑制活性分别达到5 nM和9 nM，但对β2亚基的抑制活性较弱。
- **亲脂性侧链**（如环丙基、环戊基）：因与β5c和β5i的疏水口袋更匹配，表现出广谱抑制活性。例如，5l（P1环戊基）对β5c和β5i的抑制活性与硼替佐米相当，但对β1c的抑制活性较低（IC50=1 μM），提示其可能通过β5亚基介导细胞毒性。

#### 2. **细胞毒性与选择性平衡**
尽管多数化合物的亚基选择性优于硼替佐米，但其抗癌活性未显著超越现有药物。例如，5l对多种癌症细胞线（如MCF-7、MDA-MB-231）的半数抑制浓度（IC50）在50-250 nM范围内，与硼替佐米相当。研究团队推测，这可能源于β2亚基的抑制不足——β2亚基对非极性P1侧链的识别至关重要，而当前化合物的β2亚基抑制活性较弱（IC50>400 nM）。未来需通过引入刚性或极性基团优化β2抑制活性。

#### 3. **抗炎活性的临床相关性**
通过体外实验评估化合物对脂多糖（LPS）刺激的 peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）分泌炎症因子（如IL-6、TNF-α）的影响，发现以下规律：
- **β1i/β5i双靶向化合物**（如5b、5c、5l）：在250 nM浓度下显著抑制IL-6（减少>80%）、IL-8（减少>70%）和TNF-α（减少>60%）的分泌，其效果与已上市的KZR-616（扎米替尼）相当。
- **单一亚基靶向化合物的局限性**：仅抑制β1i或β5i的化合物（如5a、5g）对炎症因子抑制效果较弱，提示多亚基协同抑制可能是抗炎活性的关键机制。
- **非细胞毒性验证**：所有化合物在250 nM浓度下均未显著抑制PBMCs或HUVECs的存活，表明其选择性优于传统硼替佐米。

#### 4. **药代动力学与ADME特性**
以化合物5l为例，其药代动力学特性与硼替佐米高度相似：
- **溶血性**：5l在生理pH下的溶解度（>200 μM）显著优于硼替佐米，解决了后者因高蛋白结合率导致的生物利用度问题。
- **肠道吸收**：Caco-2细胞模型显示，5l的跨膜渗透率（Papp=17.1×10?? cm/s）与硼替佐米（20.7×10?? cm/s）相当，表明其吸收特性相似。
- **代谢稳定性**：5l在肝微粒体中的代谢稳定性（保留率>90%）优于硼替佐米（保留率约70%），可能与其缺乏易被氧化酶识别的苯甲酰胺结构有关。

### 创新性与应用前景
1. **结构-活性关系（SAR）的突破**
研究首次系统展示了P1侧链对β5i/β5c选择性（亚型差异达10倍）和β1i/β1c选择性（亚型差异>100倍）的影响规律。例如，苯基取代的5a对β5i的抑制活性（220 nM）仅为β5c（IC50=4 μM）的5%，而环丙基取代的5k对β1i的抑制活性（270 nM）仅为β1c（IC50=3.5 μM）的8%。这为设计亚型特异性抑制剂提供了结构基础。

2. **临床转化潜力**
- **抗肿瘤应用**：5l等化合物在固体瘤模型（如HepG2肝细胞癌）中显示潜力，其高β5i抑制活性可能通过阻断NF-κB信号通路增强抗肿瘤效果。
- **免疫调节治疗**：针对PBMCs的炎症抑制活性，5l有望在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病中替代传统免疫抑制剂（如激素）。
- **联合用药策略**：与β2i抑制剂（如Lu-002i）联用可能通过多靶点抑制增强疗效。

3. **合成技术的优化**
研究中开发的KATs不对称还原法，成功将α-氨基硼酸酯的立体纯度提升至92%-99%，解决了以往合成中手性拆分困难的问题。此技术可扩展至其他手性氨基硼酸酯的制备，为后续药物开发奠定基础。

### 局限性与未来方向
1. **局限性**
- **亚基覆盖不全**：现有化合物对β2亚基的抑制活性普遍较弱（IC50>400 nM），需进一步探索刚性芳香环或离子相互作用基团。
- **体内实验缺失**：目前所有数据均基于体外模型，需开展小鼠原位实验验证抗炎活性。

2. **未来研究方向**
- **多靶点设计**：结合β5i抑制与mTOR通路靶向，可能提升抗肿瘤效果。
- **长效制剂开发**：利用硼酸酯的 reversibility 特性，开发可开关式药物（如与纳米载体结合）。
- **毒性机制解析**：需结合蛋白质组学技术，明确硼替佐米相关神经毒性是否与β1c亚基抑制有关。

### 结论
本研究通过系统化P1侧链的理性设计，揭示了α-氨基硼酸酯类化合物对蛋白酶体亚基的选择性调控机制。其中，5l等化合物在保留硼替佐米广谱抑制活性的同时，显著降低了β1c亚基的抑制活性（IC50=1 μM vs 50 nM），且在抗炎效果上达到临床候选药物水平。这些发现不仅填补了P1位点结构多样性的研究空白，更为开发下一代低毒高效蛋白酶体抑制剂提供了关键理论依据和候选分子。