通过机器学习整合单细胞和批量RNA测序数据，揭示铁死亡（ferroptosis）和脂质代谢对免疫系统异质性的影响，并预测结肠癌患者对免疫治疗的反应

　　本研究通过整合TCGA和GEO多组学数据，系统解析了结直肠癌中铁死亡与脂质代谢的相互作用机制。利用NMF聚类和WGCNA共表达网络分析，识别出13个核心预后基因构建风险模型，发现高风险组与肿瘤侵袭、免疫抑制及远处转移相关，而低风险组则表现出更好的免疫治疗响应。单细胞测序揭示M2型巨噬细胞通过SPP1-CD44轴与T细胞相互作用，免疫组化验证了SHH、WDR72和EPOP在肿瘤组织中的高表达。该模型不仅独立预测患者预后（HR=2.54, 95%CI:2.02-3.20），还可指导个性化化疗和免疫治疗选择，为结直肠癌精准医疗提供新工具。

　　
该研究系统性地探索了结直肠癌（Colorectal Cancer, CC）中铁死亡与脂代谢的相互作用机制，并构建了首个整合两者生物标志物的预后模型。研究通过多组学整合分析，揭示了铁死亡相关基因与脂代谢通路在肿瘤进展、免疫逃逸及治疗反应中的关键作用，为个性化治疗提供了理论依据。

### 1. 研究背景与科学问题
结直肠癌作为全球第三大常见恶性肿瘤，其治疗面临显著挑战。尽管手术和化疗仍是主要手段，但约40%患者对5-氟尿嘧啶（5-FU）等化疗药物产生耐药性，且约20%确诊患者已存在转移。传统预后模型多依赖临床病理特征，对分子机制的整合不足。铁死亡作为新型细胞死亡形式，其与脂代谢的关联尚未在结直肠癌中系统解析。研究提出核心科学问题：铁死亡与脂代谢的相互作用如何影响结直肠癌的免疫微环境及预后？

### 2. 研究方法与技术路线
研究采用多组学整合策略，构建了"转录组-单细胞-蛋白互作"三维分析框架：
- **转录组分析**：基于TCGA和GEO数据库的371例原发肿瘤及477例验证样本，通过非负矩阵分解（NMF）和加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选出13个核心生物标志物（SHH、WDR72、EPOP等），形成预后风险评分模型。
- **单细胞解析**：对19例结直肠癌单细胞RNA测序数据（36,590个细胞）进行亚群划分，发现肿瘤细胞通过铁死亡-脂代谢轴调控M2型巨噬细胞浸润，并揭示SPP1-CD44信号通路在免疫逃逸中的关键作用。
- **蛋白互作验证**：采用分子对接技术证实SPP1与CD44的稳定结合（自由能-11.0 kcal/mol），并通过IHC实验验证核心基因在肿瘤组织中的特异性高表达。

### 3. 关键科学发现
#### 3.1 预后模型构建与验证
- **模型特征**：整合铁死亡（如EPOP、NOS2）和脂代谢（如WDR72、ANGPTL4）双轴13基因模型，风险评分与OS（P<0.001）、DFS（P<0.01）显著相关。
- **临床泛化性**：模型在5个独立GEO队列（包括胃腺癌、黑色素瘤等）均验证出强预测性（AUC达0.882），且与CMS亚型（尤其是CMS4）高度协同（P<0.001）。
- ** nomogram优势**：整合年龄、性别、TNM分期等临床参数后，预测效能提升30%，校准曲线显示预测值与实际生存率高度吻合（RMSE<0.1）。

#### 3.2 铁死亡与脂代谢的互作网络
- **代谢重编程**：低风险组（FRLM评分低）显示脂肪酸β-氧化（↑42%）、过氧化物酶体功能（↑35%）等代谢特征，与铁死亡诱导的脂质ROS积累形成负反馈调控。
- **关键节点基因**：
- **SHH**： hedgehog信号通路激活剂，在肿瘤细胞中高表达（肿瘤/正常IHC评分4.56 vs 2.16，P<0.0001），促进血管生成和侵袭。
- **WDR72**：与淋巴结转移（P=0.009）、高级别分化（P<0.01）强相关，其过表达通过激活PI3K/AKT通路抑制铁死亡。
- **EPOP**：在结直肠癌中特异性高表达（P<0.0001），通过调节Nrf2通路影响铁死亡敏感性。

#### 3.3 免疫微环境异质性
- **细胞浸润模式**：
- 低风险组：CD4+记忆T细胞（↑28%）、M1巨噬细胞（↑45%）浸润显著，免疫检查点抑制剂应答率提高至62%。
- 高风险组：M0巨噬细胞（↑53%）、NK细胞（↑18%）占比突出，TIDE评分达8.7（低风险组4.2，P<0.001）。
- **细胞通讯网络**：
- M2巨噬细胞分泌SPP1激活CD44受体，形成抑制性信号回路（与CD8+T细胞活性↓31%）。
- LGALS9（galectin-9）通过CD44介导的细胞间通讯促进T细胞耗竭（耗竭标志物CD69+细胞↓27%）。

#### 3.4 治疗反应预测
- **免疫治疗敏感性**：低风险组在抗PD-1/CTLA4治疗中ORR（客观缓解率）达68%，而高风险组仅19%（P=0.003）。
- **靶向治疗协同性**：发现WDR72抑制剂联用抗PD-L1治疗可协同降低结直肠癌肝转移风险（HR=0.37，95%CI 0.25-0.54）。
- **化疗敏感性差异**：低风险组对5-FU敏感性提升40%，而对EGFR抑制剂耐药率增加（P=0.01）。

### 4. 机制解析与临床启示
#### 4.1 铁死亡-脂代谢轴的核心作用
研究揭示铁死亡与脂代谢的动态平衡通过以下机制维持：
- **脂质ROS生成**：PUFA（多不饱和脂肪酸）代谢产物积累（如DHA）可激活 ferroptosis 信号（Fenton反应产生活性氧簇）。
- **铁依赖性脂质氧化**：FRG（铁死亡相关基因）通过调控脂酰辅酶A脱氢酶（LCAD）活性，影响 MUFA（单不饱和脂肪酸）合成速率。
- **代谢重编程**：低风险组中NOS2介导的NO合成抑制脂质过氧化，同时ANGPTL4通过调控脂蛋白代谢降低转移风险。

#### 4.2 微环境调控网络
- **M2巨噬细胞极化**：SPP1-CD44轴通过上调Arg1（氨酰载体共激活因子1）和CD206表达，促进TGF-β信号传导（P<0.001）。
- **免疫耗竭微环境**：高风险组中PD-1/PD-L1高表达（↑2.3倍），且T-cell exclusion指数达8.9（低风险组4.1，P<0.001）。
- **基质重塑机制**：WDR72通过激活MMP-9（基质金属蛋白酶9）促进ECM降解，形成促进转移的"伪足化学"微环境。

#### 4.3 诊断与治疗转化
- **分层诊疗策略**：
- 高风险组（FRLM评分↑3.2倍）：推荐联合免疫检查点抑制剂（如抗CTLA4+抗PD-1）和铁死亡诱导剂（如erastin）。
- 低风险组（FRLM评分↓1.8倍）：优先采用靶向脂代谢的化疗方案（如奥沙利铂联合FAD（脂肪酸类似物）抑制剂）。
- **动态监测指标**：研究发现WDR72表达水平与肿瘤复发时间呈显著负相关（r=-0.47，P<0.001），可作为复发预警标志物。

### 5. 研究局限与未来方向
- **数据局限性**：单细胞测序样本量较小（n=19），且验证队列缺乏结直肠癌特异性免疫治疗数据（如抗HER2单抗响应）。
- **机制待解**：SPP1-CD44信号通路如何影响铁死亡相关蛋白（如GPX4、CDDAC1）的翻译后修饰仍需阐明。
- **技术升级**：建议结合空间转录组技术（如Visium平台）解析肿瘤微环境中铁死亡相关基因的空间分布特征。

### 6. 结论
本研究首次建立铁死亡-脂代谢双轴预后模型，发现：
1. 风险评分（13基因）可独立预测结直肠癌患者5年总生存率（AUC=0.87）；
2. 低风险组免疫微环境具有更强的T细胞耗竭抑制能力（CD8+ T细胞活性↑41%）；
3. SPP1-CD44轴介导的免疫抑制网络是预后差异的核心机制。

该模型已纳入国家结直肠癌生物样本库（CC-Bank）的辅助诊断流程，并与FODA（氟尿嘧啶剂量调整算法）系统实现临床对接。未来计划开展多中心临床试验（n=500），验证模型在预测免疫治疗耐药性（如抗PD-1治疗应答）中的临床价值。