高度可调且可重塑细胞结构的硫醇-烯丙基海藻酸盐-肽交联水凝胶：用于重现细胞和类器官微环境以进行生物制造

《Advanced Healthcare Materials》：Highly Tunable and Cell-Remodelable Thiol-ene Alginate-Peptide Crosslinked Hydrogels to Recreate Cellular and Organoid Microenvironments for Biofabrication

　　细胞介导的可降解果胶酸盐水凝胶系统通过紫外线交联及金属蛋白酶降解序列实现生物可调控性，支持多种器官oid（如子宫内膜、甲状腺滤泡、肠道）及血管内皮细胞和神经细胞的体外三维培养，适用于生物打印技术，提供了一种可替代动物来源基质（Matrigel）的伦理替代方案。

　　
该研究开发了一种基于可溶性 alginate 和 norbornene 功能化聚合物的生物可降解水凝胶系统，旨在通过调控物理和生物化学特性，为器官类模型培养和生物制造技术提供替代方案。材料通过光交联技术实现快速成型，其降解速度可通过酶解序列设计进行精准控制，同时支持多种敏感细胞类型的包裹与功能维持。

### 材料创新与制备工艺
研究团队选用钠 alginate 作为基础生物材料，通过二硫键交联反应构建可降解网络结构。具体而言，采用 DMTMM 活化法将 norbornene 基团引入 alginate 分子链，形成光敏性预凝胶溶液。这种 norbornene-alginate 复合材料具有以下优势：
1. **机械性能可调**：通过改变 alginate 浓度（1%-3% w/v）和交联剂浓度（0.5-2 mM），可精确调控水凝胶的弹性模量（320 Pa-2.1 kPa），实现从软组织模拟到固态器官支撑的多样化应用。
2. **光控成型**：利用 UV 365 nm 照射激活 thiol-ene 偶联反应，成型时间仅需 30 秒，避免传统化学交联法中高温对细胞活性的破坏。
3. **酶解可控**：嵌入的 MMP-cleavable序列（CGDGVPLSLYSGGDGC）可在 37℃胶原酶溶液中实现快速降解（8 小时质量损失达 18.6 mg），而常规 PEG 交联水凝胶仅保留 0.1 mg 降解量。

### 细胞相容性与器官模型支持
#### 器官类模型培养验证
1. **人子宫内膜器官类**：在 1% alginate-norbornene、0.5 mM 交联剂体系下，器官类模型保持 7 天以上存活率（Calcein/ethidium染色显示活细胞占比 >95%），直径从 85.3 μm 增长至 156.7 μm，并表达 E-cadherin（细胞间连接）和 Ki67（增殖标志物）。
2. **小鼠胚胎甲状腺滤泡**：4 天培养后形成典型滤泡结构（直径 325 μm），表达 Tg（甲状腺球蛋白）和 T4（甲状腺素）标志物，Ki67 阳性细胞占比达 68%。
3. **小鼠胚胎肠道器官类**：7 天培养后形成具有杯状上皮-基底膜极性的三维结构，E-cadherin 表达强度较对照组提升 2.3 倍。

#### 血管化与神经再生潜力
- **内皮细胞共培养**：HUVECs 与 MSCs 按 9:1 比例共培养，在 3% alginate 水凝胶中 24 小时即出现血管样突起（CD31 标记），7 天后形成连续网状结构。
- **神经再生实验**：人诱导多能干细胞（iPSCs）来源神经球在 1% alginate 水凝胶中培养 8 天后，βIII-tubulin 标记显示轴突长度达 253 μm（单根最长 517 μm），形成树状突起网络。

### 技术优势与局限
#### 核心创新点
1. **双参数调控体系**：通过独立调节 alginate 浓度（影响流变学特性）和交联剂浓度（控制降解速率），实现机械性能与生物降解性的解耦。例如 1% alginate + 1 mM 交联剂体系兼具最佳打印性能（纤维厚度 0.93 ± 0.10 mm）和适中的降解速率。
2. **模块化功能化设计**：采用 norbornene 作为光敏交联位点，同时保留末端的半胱氨酸作为功能化接口，支持后续偶联 RGD（细胞粘附）、VEGF-mimicking 多肽（促进血管化）等其他生物活性分子。
3. **生物打印兼容性**：通过气动挤出系统（压力 50 kPa，速度 3 mm/s）实现 20 μL 级别的精准打印，纤维分布均匀性达 96.5%。

#### 现存挑战
1. **批次一致性**：alginate 原料分子量分布（380 kDa 标称值）影响 norbornene 功能化效率，需建立标准化纯化流程（如活性炭吸附-多级过滤法）。
2. **降解速率控制**：MMP 交联序列降解存在阈值效应，当交联剂浓度 >1.5 mM 时，降解速率与细胞活性呈现负相关（p<0.01）。
3. **长期稳定性**：实验周期最长为 8 天，需验证水凝胶在 28 天以上培养中的机械性能衰减规律。

### 应用前景
该平台已成功应用于：
- **疾病模型构建**：通过调节降解速率（8-72 h 可调），可模拟不同病理阶段组织重塑过程。
- **药物筛选系统**：在 3D 甲状腺滤泡模型中，抗甲状腺药物米诺地尔（minoxidil）处理组 T4 分泌量较对照组降低 41%。
- **神经工程应用**：与微型电极阵列集成后，可检测神经球突触形成速率（1.2 ± 0.3 突触/小时）。

### 材料优化方向
1. **复合交联体系**：引入 PEG 线型分子（分子量 2 kDa）作为物理增稠剂，可将水凝胶弹性模量提升至 4.2 kPa（p<0.001）。
2. **动态降解调控**：开发含双功能化 norbornene 的分子（一端光交联，另一端含 VEGF 模拟序列），实现降解与细胞外基质合成的协同调控。
3. **多尺度打印**：通过直径 25-200 μm 的可调针头（已测试 22G、18G、16G 针头），可实现从微米级血管网络到毫米级器官模型的连续打印。

该研究为生物可降解水凝胶平台提供了重要参考，特别是在复杂器官模型构建方面。后续研究可结合活细胞成像（如荧光钙成像）和力学传感技术，实现器官类模型的动态监测与反馈调控。