ALYREF介导的m5C修饰通过NSUN2/ALYREF/LGR4轴促进卵巢癌铂类耐药的多组学机制研究

《Cell Death & Disease》：Multi-omics analysis reveals that ALYREF-mediated m5C modification promotes platinum resistance in ovarian cancer via the NSUN2/ALYREF/LGR4 axis

　　本研究针对卵巢癌铂类耐药的临床难题，揭示了m5C RNA修饰的关键作用。通过多组学分析发现，甲基转移酶NSUN2催化LGR4 mRNA编码区的m5C修饰，被阅读蛋白ALYREF特异性识别后增强mRNA稳定性，进而激活Wnt/β-catenin通路。该研究首次阐明NSUN2/ALYREF/LGR4信号轴在铂类耐药中的机制，为逆转耐药提供了新靶点。

　　

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的癌种，其中高级别浆液性卵巢癌（HGSC）是最常见的病理类型。尽管手术联合铂类化疗初始有效率较高，但绝大多数患者最终会产生铂类耐药导致治疗失败。铂类耐药已成为卵巢癌临床治疗的主要瓶颈，其分子机制亟待深入探索。近年来，RNA表观遗传修饰在肿瘤发生发展中的作用日益受到关注，其中5-甲基胞嘧啶（m⁵C）修饰作为重要的转录后调控机制，通过影响RNA稳定性、核质转运等过程参与肿瘤进展，但其在卵巢癌铂类耐药中的具体作用尚不明确。

在这项发表于《Cell Death & Disease》的研究中，研究人员通过整合多组学分析技术，系统揭示了ALYREF介导的m⁵C修饰在卵巢癌铂类耐药中的关键作用及分子机制。

研究主要采用了以下关键技术方法：基于TCGA和GEO数据库的生物信息学分析、单细胞转录组测序、体外构建铂类耐药细胞株模型、RNA干扰和过表达技术、RNA结合蛋白免疫沉淀测序（RIP-Seq）、m⁵C甲基化测序（BIS-Seq）、蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫荧光、小鼠异种移植模型等。临床样本来源于上海通用医院的67例HGSC组织和13例输卵管组织。

研究结果如下：

ALYREF与卵巢癌 cisplatin 耐药相关

研究人员成功构建了 cisplatin 耐药的A2780/DDP和SKOV3/DDP细胞系，发现耐药细胞中总RNA m⁵C甲基化水平显著升高。通过RNA测序分析，筛选出13个m⁵C相关基因中，阅读蛋白ALYREF在耐药细胞中表达显著上调。临床样本验证显示，ALYREF高表达与铂类耐药显著相关，且高表达患者对 cisplatin 和紫杉醇敏感性降低。

单细胞测序识别铂类耐药卵巢癌细胞亚群

通过单细胞转录组分析，研究人员将HGSC细胞分为 cisplatin 敏感（HGSC-S）和耐药（HGSC-R）两组，发现HGSC-tumor3亚群富含耐药细胞，且该群细胞中金属硫蛋白家族基因显著上调。细胞通讯分析显示HGSC-tumor3通过WNT信号通路与其他亚群广泛互动，提示其可能介导肿瘤微环境中的耐药信号传递。

ALYREF参与卵巢癌恶性表型及 cisplatin 耐药形成

功能实验表明，敲低ALYREF可显著增强 cisplatin 敏感性，抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力；而过表达ALYREF则产生相反效果，证实ALYREF在维持卵巢癌恶性表型中的关键作用。

ALYREF通过激活Wnt/β-catenin通路促进 cisplatin 耐药

整合RNA-Seq和m⁵C-BIS-Seq数据发现，ALYREF主要调控Wnt信号通路相关基因。机制上，m⁵C修饰富集于编码区（CDS）和3'非翻译区（3'UTR），且ALYREF通过与甲基转移酶NSUN2协同作用，特异性识别LGR4 mRNA上的m⁵C修饰位点。

NSUN2介导LGR4 mRNA的m⁵C甲基化促进 cisplatin 耐药

NSUN2敲低显著降低LGR4表达和mRNA稳定性，而过表达产生相反效果。m⁵C-RIP实验证实NSUN2主要催化LGR4 mRNA CDS区的m⁵C修饰，该修饰是ALYREF识别的前提条件。

ALYREF通过识别m⁵C修饰增强LGR4稳定性

ALYREF直接结合LGR4 mRNA的m⁵C修饰位点，促进其核质转运和稳定性。突变ALYREF的m⁵C结合位点（K171A）后，其对LGR4的调控作用消失。动物实验进一步验证ALYREF敲低可显著抑制肿瘤生长并逆转 cisplatin 耐药。

研究结论表明，NSUN2/ALYREF/LGR4轴通过m⁵C依赖性机制激活Wnt/β-catenin信号通路，是卵巢癌铂类耐药的重要驱动因素。该研究不仅首次阐明了m⁵C阅读蛋白ALYREF在肿瘤耐药中的功能，还揭示了RNA表观遗传修饰与经典信号通路交叉对话的新机制。值得注意的是，研究发现ALYREF作为阅读蛋白可能通过反馈调节影响m⁵C甲基化水平，这为理解表观遗传调控网络的复杂性提供了新视角。这些发现为开发靶向ALYREF的卵巢癌耐药逆转策略提供了理论依据，具有重要的临床转化价值。