胆固醇促进了受体酪氨酸激酶ROR1的二聚体和寡聚体的形成

《Journal of Biological Chemistry》：Cholesterol promotes the formation of dimers and oligomers of the receptor tyrosine kinase ROR1

　　ROR1自组装形成二聚体和寡聚体，其过程不依赖Wnt5a配体结合，而是由跨膜域介导，胆固醇通过调控跨膜域相互作用促进自组装。单分子技术结合脂质颗粒和突变分析揭示了ROR1自组装的新机制，为肿瘤治疗提供新靶点。

　　
这篇研究聚焦于ROR1蛋白在细胞膜中的自组装机制及其与胆固醇的相互作用。研究团队通过单分子荧光技术、生物信息学预测和膜生物学实验，揭示了与传统受体酪氨酸激酶（RTKs）不同的ROR1激活机制，并首次证实膜胆固醇是调控ROR1自组装的关键因素。

### 一、核心发现
1. **非配体依赖性自组装**
传统RTKs（如EGFR）通过配体结合触发二聚化，但ROR1的寡聚体形成不依赖Wnt5a等配体。单分子成像技术（SiMPull-POP）显示，在生理条件下ROR1以单体（49.2%）、二聚体（30.7%）和寡聚体（25.5%）为主，且配体处理不影响这一分布。

2. **跨膜结构域（TMD）的关键作用**
- 通过生物信息学预测（PredDimer和AlphaFold2），确定ROR1 TMD存在两个潜在二聚化界面：I414-I418（异亮氨酸对）和L416-L420（亮氨酸对）。
- 突变实验证实这两个界面对TMD自组装至关重要。突变后，BiFC荧光信号显著下降，表明TMD通过双界面协同作用形成二聚体。
- 原核系统（大肠杆菌）的BLaTM实验显示，ROR1 TMD在无胆固醇的细菌膜中自组装能力较弱，支持胆固醇促进ROR1成膜聚集的结论。

3. **胆固醇的调控机制**
- 甲基β-环糊精（MβCD）处理降低细胞膜胆固醇水平后，ROR1单体比例上升（41.7%→56.5%），寡聚体比例下降（25.5%→18.3%）。
- TMD自组装实验表明，胆固醇剥夺后VFP荧光信号降低，证实胆固醇通过影响TMD构象促进自组装。
- GPMV分相实验显示，ROR1更倾向于液态无序（L_o）膜区，但胆固醇剥夺未改变其分相系数（K_p≈2.5），提示胆固醇可能通过构象效应而非定位效应调控ROR1。

### 二、机制解析与对比
1. **与传统RTKs的差异**
- **配体依赖性**：EGFR等RTKs通过配体结合诱导构象变化和二聚化，而ROR1自组装不依赖配体，其TMD结构本身具有自组装倾向。
- **脂质调控模式**：胆固醇对ROR1的作用类似其他RTKs的脂质配体（如PI(4,5)P₂），但此研究首次明确胆固醇通过TMD双界面协同作用促进自组装。
- **膜微域分布**：与EphA2（K_p=6）相比，ROR1更偏好液态有序（L_o）区，但胆固醇浓度变化未显著改变其分相行为，提示可能存在动态平衡。

2. **分子互作网络扩展**
- ROR1通过TMD与自身形成同源二聚体/寡聚体，同时其伪激酶结构域与ROR2形成异源二聚体（临床靶向策略）。
- 胆固醇可能通过两种途径影响ROR1：
a) **直接结合**：改变TMD疏水结构，促进双界面接触；
b) **间接效应**：调节膜流动性，影响寡聚体稳定性（需进一步验证）。

### 三、临床转化潜力
1. **癌症治疗靶点**
- ROR1高表达与乳腺癌、胰腺癌等预后不良相关，且其自组装特性使其成为单抗（如抗ROR1/2异源二聚体抗体）的潜在靶点。
- 胆固醇调控机制为开发新型抑制剂提供方向，例如设计可竞争性结合TMD双界面的小分子或脂质类似物。

2. **联合治疗策略**
- 研究显示，ROR1在L_o区富集，而Wnt配体（如Wnt5a）通常通过脂肪酸修饰靶向L_o。因此，可能存在胆固醇-配体协同调控ROR1活性的机制，需结合脂质组学进一步探索。

### 四、研究局限与展望
1. **技术局限性**
- SiMPull-POP技术可能低估寡聚体数量（如三聚体可能被归类为≥3步）。
- 细菌系统实验未完全排除宿主膜环境差异的影响。

2. **未来研究方向**
- **结构生物学**：解析胆固醇结合的TMD构象变化，以及与其他蛋白（如LRP6、Fzd4）的复合物结构。
- **动态监测**：开发实时成像技术，观察ROR1自组装的时空演变。
- **脂质组学验证**：系统评估其他膜脂（如鞘磷脂）对ROR1的影响，明确胆固醇的核心作用。

### 五、研究意义
该成果首次阐明ROR1自组装的脂质调控机制，突破传统RTKs研究框架。其发现：
- 解释了ROR1在胚胎发育和癌症中的双重作用：配体非依赖性自组装可能维持其稳态激活；
- 提出胆固醇作为新型调控因子，可能成为多靶点癌症治疗的突破口；
- 为设计靶向ROR1寡聚体的药物（如TMD双界面抑制剂）提供理论依据。

研究团队通过跨学科方法（单分子成像、结构预测、膜生物学）揭示了ROR1独特的激活机制，为Wnt信号通路研究开辟新方向，并为实体瘤和血液系统恶性肿瘤提供潜在治疗靶点。