RNA测序确定了用于发酵乳中Lactiplantibacillus plantarum逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测的稳定参考基因

《Journal of Dairy Science》：RNA sequencing reveals stable reference genes for reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction monitoring of Lactiplantibacillus plantarum in fermented milk

　　Lactiplantibacillus plantarum 的稳定参考基因筛选及发酵乳制品中 viability 监测的分子验证。通过 RNA测序结合多算法分析，首次系统鉴定 tagO 和 dnaG 为该菌在四种发酵条件下最稳定的内参基因，RT-qPCR 验证显示其 quantification 准确性与平板计数高度一致，优于传统基因如 GAPDH 和 16S rRNA。该框架为益生菌制品的 quality control 提供创新方法。

　　
本研究针对乳酸植物乳杆菌（*Lactiplantibacillus plantarum*）在发酵及储存过程中参考基因（RG）的稳定性问题，通过转录组测序和多算法交叉验证，首次系统筛选出适用于该菌的稳定RG，并验证其在乳制品发酵中的实际应用价值。研究采用RNA测序技术，结合geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四大算法，对3,092个基因的表达稳定性进行评估，最终筛选出22个低变异系数（CV<0.1）的候选RG。其中，*tagO*（未端丙二酰基转移酶）和*dnaG*（DNA聚合酶γ亚基）在四组发酵条件下均表现出极低的变异（CV分别为2.23%和2.24%），显著优于传统RG如GAPDH（CV=8.57%）和16S rRNA（CV=32.11%）。该成果为乳酸菌类尤其是发酵乳制品中活菌数的精准检测提供了新的技术框架。

### 关键发现解析
**1. 传统RG的局限性**
传统使用的GAPDH、16S rRNA和recA等基因在乳酸植物乳杆菌的发酵过程中表现出显著的不稳定性。例如，16S rRNA由于基因组拷贝数多（平均4.6拷贝），在平板计数法中可能高估实际活菌数；而GAPDH在发酵第12小时后出现明显表达波动，导致RT-qPCR数据偏离真实值。研究通过构建包含不同发酵阶段（标准MRS培养基、补充烟酰胺的MRS培养基）和温度（37℃、含烟酰胺的37℃）的四组实验条件，揭示了环境胁迫对传统RG表达的影响机制。

**2. 新RG的生物学功能与稳定性关联**
筛选出的*dnaG*编码DNA聚合酶γ亚基，该蛋白参与DNA复制和修复过程，其稳定表达符合细菌维持基本代谢的核心需求。而*tagO*作为细胞壁肽聚糖-N-乙酰葡糖胺转移酶，参与细胞壁合成，其表达稳定性与乳酸菌的形态完整性直接相关。两种基因在发酵全周期（12-28天）及不同温度（4℃、25℃、37℃、45℃）下均保持低变异系数，表明其表达受环境因素调控较小。

**3. 实际应用验证的突破性进展**
在发酵乳制品储存实验中，使用*dnaG*和*tagO*作为RG的RT-qPCR检测法，成功捕捉到传统平板计数无法检测的“可逆休眠”（viable but nonculturable, VBNC）状态细菌。例如，在4℃储存28天后，传统方法低估活菌数达3个数量级（1.27×10^9 cfu/mL vs. 1.04×10^8 RT-qPCR检测值），而新RG体系能准确反映活菌衰减趋势（相对误差<15%）。此外，在45℃高温冲击测试中，*tagO*的表达波动仅为传统RG的1/5（ΔCt=1.2 vs. 6.0），证实其热稳定性优势。

**4. 多算法验证体系的科学意义**
研究创新性地将四大主流算法（geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder）进行交叉验证，发现：
- geNorm显示*dnaG*（M=0.123）和*lp_1267*（转录调节蛋白）为最优RG
- NormFinder综合评分显示*tagO*（0.136）稳定性最高
- BestKeeper算法中*dnaG*的r值达0.993，表明与群体均值的强相关性
- RefFinder整合排名中*dnaG*（2.21）超越传统基因gyrB（17.2）8倍
这种多维度验证机制有效规避了单一算法的局限性，确保结论可靠性。

### 技术革新与产业应用
**1. 转录组导向的RG筛选范式**
区别于传统经验性选择RG，本研究通过RNA-seq数据挖掘（单细胞水平转录谱分析），建立了包含基因功能注释（如DNA复制相关基因）、表达稳定性（CV<0.1）、扩增效率（90.95%-134.98%）的三维筛选标准。特别值得注意的是，筛选过程引入了发酵动态条件（pH波动、营养消耗、代谢产物积累），使得到的RG更适合工业级连续发酵场景。

**2. 乳制品质量控制的精准化**
在发酵乳中，传统RT-qPCR采用GAPDH作为内参时，活菌计数误差可达400%（实验数据：实测值1.27×10^9 vs. GAPDH校正值5.09×10^9）。而采用*dnaG*校正时，误差率降低至7.3%，与平板计数偏差<15%。该技术突破对解决乳制品中“假阴性”检测问题（如低温储存导致的VBNC状态）具有重要价值。

**3. 代谢调控研究的工具升级**
新RG体系为解析乳酸菌代谢通路提供了可靠工具。例如，在添加烟酰胺的发酵条件下，*tagO*表达量稳定在85-90 TPM（转录单位/百万碱基），而GAPDH出现3.8倍的波动（SD=655.15），这直接导致利用GAPDH校正的β-半乳糖苷酶活性数据出现系统性偏差（误差率>200%）。

### 行业影响与未来方向
本研究成果已应用于某乳企的益生菌发酵液检测，使其产品活菌计数标准差从1.2×10^8降低至3.5×10^7，检测成本下降40%。未来研究建议：
1. 构建跨菌属（如*Streptococcus thermophilus*、*Bifidobacterium animalis*）的RG稳定性数据库
2. 开发基于微流控芯片的便携式RT-qPCR设备，满足现场快速检测需求
3. 研究极端条件（如添加抗生素、电离辐射）下新RG的稳定性边界

该研究不仅填补了乳酸植物乳杆菌RG筛选的技术空白，更开创了"功能稳定性优先于基因保守性"的RG筛选新理念，为益生菌检测、发酵工艺优化和质量控制提供了普适性解决方案。据市场分析机构预测，该技术的应用可使全球发酵乳制品行业每年减少约2.3亿美元的次品损失。