原子力显微镜表征角质细胞弹粘塑性生物力学特性的标准化方案

《Communications Biology》：Atomic force microscope protocols for characterising the elastoviscoplastic biomechanical properties of corneocytes

　　本研究针对原子力显微镜（AFM）表征角质细胞（corneocytes）杨氏模量存在较大变异性的问题，开发了一套标准化实验方案。研究人员通过精确校准探针几何形状，采用PDMS参考材料确定有效针尖形态，并在干燥条件下对角质细胞进行纳米压痕和应力松弛实验。结果发现角质细胞在干燥状态下表现出类似玻璃态有机聚合物的杨氏模量（0.2-1.6 GPa），其弹粘塑性行为符合Herschel-Bulkley模型。该研究为皮肤生物力学研究提供了可靠方法，对仿生材料开发和皮肤病学研究具有重要意义。

　　

皮肤作为机体与外界环境的第一道防线，其机械完整性对维持屏障功能至关重要。然而，在皮肤力学研究中，最表层的角质层（Stratum Corneum, SC）及其基本单元角质细胞（corneocytes）的力学特性研究长期被忽视。更令人困惑的是，文献中报道的角质细胞杨氏模量值存在巨大差异，从几MPa到0.4 GPa不等，这种变异主要源于原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）实验方案的不一致性。

以往研究通常假设角质细胞仅发生弹性变形，因此采用基于球形压头的Hertz或JKR模型分析加载-卸载曲线。但研究表明，在压入角质细胞时会在屈服应变处发生塑性变形。此外，探针几何形状的不确定性、基底选择不当以及数据分析方法的差异，都导致了测量结果缺乏可比性。这些不确定性严重阻碍了对角质细胞力学特性的准确理解，也限制了在仿生材料和皮肤病学领域的应用。

为了解决这些问题，伯明翰大学的研究团队在《Communications Biology》上发表了题为"Atomic force microscope protocols for characterising the elastoviscoplastic biomechanical properties of corneocytes"的研究论文，开发了一套完整的AFM标准化方案，用于准确表征角质细胞的弹粘塑性生物力学特性。

关键技术方法

本研究主要采用原子力显微镜（AFM）纳米压痕技术，通过对PDMS参考材料进行压痕实验精确校准探针几何形状，并在控制环境条件（25.5°C，35%相对湿度）下，对3名健康成人前臂采集的角质细胞进行纳米压痕和应力松弛实验，结合自定义MATLAB脚本进行数据分析。

探针几何形状的精确校准

研究团队首先通过环境扫描电子显微镜（Environmental Scanning Electron Microscopy, ESEM）和AFM针尖表征工具对探针进行初步表征。ESEM图像显示探针呈类圆锥形状，而通过盲尖估计算法获得的针尖曲率半径为53±7 nm。

为了获得更完整的探针几何描述，研究人员在聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）参考弹性体上进行了压痕实验。通过分析加载曲线与接触刚度的关系，推导出探针的几何形状函数，建立了接触半径a与接触深度h_c的定量关系。

研究发现，传统的Hertz模型假设的抛物线几何形状（m=1.5）并不适用于实际探针几何形状，实验获得的载荷指数m随压痕深度变化，从接近1到约1.7，表明探针几何形状更接近截头圆锥体而非单一幂律形状。

角质细胞的纳米压痕与应力松弛

研究人员在控制环境条件下（25.5°C，35%相对湿度）对角质细胞进行纳米压痕实验。加载-卸载数据显示存在明显的滞后回线，表明存在粘性、塑性和/或粘附组分。通过压痕后对细胞进行成像，观察到表面存在永久性压痕，证实了角质细胞的弹塑性行为。

研究比较了角质细胞在不同基底上的杨氏模量值。附着在胶带上的细胞杨氏模量值为12-66 MPa，而固定在显微镜载玻片上的细胞杨氏模量值显著提高，达到200-1562 MPa。这种差异源于软基底（胶带）的变形性对纳米压痕结果的显著影响。

应力松弛实验显示角质细胞具有明显的时间依赖性力学行为。通过Prony级数拟合，研究人员获得了描述角质细胞粘塑性行为的材料参数，包括两个松弛时间（τ₁≈0.12-0.16 s，τ₂≈1.99-2.40 s）以及瞬时硬度H₀和长期硬度H_∞。

弹粘塑性材料模型的建立

基于实验数据，研究团队建立了描述角质细胞力学行为的Herschel-Bulkley模型。该模型将应力σ表示为塑性应变率dε_p/dt的函数：σ = σ_Y+ k(dε_p/dt)^j，其中σ_Y为准静态单轴屈服应力，k为塑性流动一致性系数，j为塑性流动指数。

研究结论与意义

本研究建立了完整的AFM纳米压痕方案，用于准确测量角质细胞的力学特性。研究证实，用于剥离角质细胞的胶带不适合作为AFM压痕测量的基底，因为其比细胞软得多，会导致杨氏模量值被严重低估。供应商提供的悬臂梁标称刚度和针尖几何形状应谨慎使用，特别是当使用标准TM悬臂对相对刚性材料进行纳米压痕时。

研究首次明确角质细胞在低应力下呈现弹性行为，但当应力达到屈服值时观察到弹粘塑性行为，这种行为可以用Herschel-Bulkley材料模型描述。角质细胞在干燥状态（35%相对湿度）下的杨氏模量值与玻璃态有机聚合物相似，这与角质层在低湿度下呈现玻璃态特性的早期研究一致。

该方法已成功应用于研究水活性对角质细胞力学特性的影响，以及描述从不同解剖部位采集的角质细胞的力学行为。这套标准化方案不仅解决了AFM表征角质细胞力学特性中的关键不确定性，还为皮肤生物力学研究提供了可靠工具，对皮肤病学研究和仿生材料开发具有重要意义。