Bottromycin A2通过特异性捕获甘氨酸递送三元复合物抑制细菌翻译的新机制

《Biochemistry (Moscow)》：A Unique Mechanism of Glycine-Specific Inhibition of Bacterial Translation by Bottromycin A2

　　本文推荐一项关于抗生素bottromycin A2(BotA2)作用机制的重要研究。针对抗菌药物耐药性日益严峻的挑战，研究人员开展了BotA2抑制细菌蛋白质合成的分子机制研究。通过高通量Toe-seq分析、生物化学和生物物理学方法，发现BotA2具有独特的序列特异性：当mRNA的A位点为甘氨酸(Gly)密码子时，能诱导核糖体停滞。研究证实BotA2不抑制Gly-tRNAGly的氨酰化，而是通过阻止EF-Tu依赖的Gly-tRNAGly完全 accommodated 进入肽基转移酶中心，特异性捕获三元复合物在核糖体上。这一新机制的阐明为开发新型靶向抗生素提供了理论依据。

　　

在抗菌药物耐药性日益成为全球公共卫生危机的背景下，寻找新型抗生素变得尤为紧迫。Bottromycin A₂(BotA2)作为一种从链霉菌中分离得到的核糖体合成和翻译后修饰肽，对多种临床相关病原体表现出显著活性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和支原体物种。然而，尽管其抗菌特性早在1957年就被发现，但其精确的分子作用机制数十年来一直模糊不清。

早期研究对BotA2的作用机制存在相互矛盾的报道：有些研究表明它可能抑制EF-G依赖的转位，另一些则认为它降低氨酰-tRNA(aa-tRNA)对A位的亲和力，还有研究显示它不影响嘌呤霉素反应。这种不确定性严重阻碍了基于BotA2结构的合理药物设计。

为了解决这一科学问题，俄罗斯科学院和多所大学的研究团队在《Biochemistry (Moscow)》上发表了他们的最新发现。研究人员采用了一套先进的技术方法，包括高通量趾印测序(Toe-seq)分析核糖体停滞位点、体外无细胞翻译系统、代谢标记实验、全局tRNA氨酰化水平分析(GATRAL)、停流荧光动力学测量以及尺寸排阻色谱等生物化学和生物物理技术。

BotA2诱导的核糖体停滞具有甘氨酸密码子特异性

通过Toe-seq分析，研究人员发现在BotA2存在下，核糖体主要在甘氨酸密码子进入A位时发生停滞，而与P位和E位的密码子身份无关。有趣的是，不同的甘氨酸密码子(GGC、GGG、GGA、GGU)在诱导核糖体停滞的效率上存在差异，其中GGC最为有效。

BotA2不影响Gly-tRNAGly的氨酰化过程

为排除BotA2通过抑制甘氨酰-tRNA合成酶发挥作用的可能性，研究人员进行了代谢标记实验和GATRAL分析。结果表明，BotA2处理不会引起(p)ppGpp的积累(严谨反应标志物)，也不会降低Gly-tRNA^Gly的水平，这说明BotA2并不影响tRNA^Gly的氨酰化过程。

BotA2允许三元复合物递送但阻止其完全容纳

通过RelE印记分析发现，BotA2处理后的核糖体在甘氨酸密码子处没有出现RelE介导的mRNA切割，表明A位点已被占据，Gly-tRNA^Gly已成功递送至A位。然而，肽键形成实验显示，BotA2完全抑制了甘氨酸的掺入，导致肽链合成停滞在甘氨酸密码子处。

BotA2通过捕获三元复合物阻止肽键形成

停流荧光实验进一步揭示，BotA2虽然允许三元复合物与核糖体结合以及密码子识别，但完全阻断了后续的GTP水解和Gly-tRNA^Gly容纳步骤。尺寸排阻色谱和免疫印迹分析证实，BotA2能将EF-Tu"困"在核糖体上，阻止其解离。

研究结论与意义

本研究最终阐明，BotA2通过一种前所未有的机制抑制细菌翻译：当甘氨酸密码子进入核糖体A位时，BotA2特异性捕获甘氨酸递送的三元复合物(EF-Tu·GTP·Gly-tRNA^Gly)，阻止Gly-tRNA^Gly完全容纳进入肽基转移酶中心，从而抑制肽键形成。

这一机制具有重要的科学意义和临床应用前景。首先，BotA2的作用机制与大多数已知的50S亚基靶向抗生素(如大环内酯类、林可酰胺类、氯霉素等)不同，不存在交叉耐药性，这为应对多重耐药菌感染提供了新的选择。其次，BotA2对甘氨酸密码子的特异性提示其可能作为研究翻译机制的工具分子。最后，这一新机制的发现为设计新型抗生素提供了思路，特别是针对EF-Tu-tRNA-核糖体界面这一相对未被探索的靶点。

值得注意的是，BotA2在生理条件下的不稳定性(特别是其甲酯基团易水解)限制了其临床应用。然而，本研究揭示的独特作用机制为开发更稳定的BotA2衍生物指明了方向，这些衍生物有望成为对抗耐药菌感染的新一代治疗药物。