基于胶体金的免疫层析试纸的研制，用于快速检测Gyrovirus homsa 1（GyH1）

《Journal of Virological Methods》：Development of a colloidal gold-based immunochromatographic strip assay for rapid detection of Gyrovirus homsa 1 (GyH1)

　　GyH1检测胶体金免疫层析法（GICA）研究成功，通过VP1蛋白多克隆/单克隆抗体联用胶体金纳米颗粒构建快速诊断试纸，灵敏度达103拷贝/μL，适用于现场便捷检测鸡传染性胃肠炎。

　　

杨琦|程子强|严天星|王桂花

山东农业大学兽医学院，中国泰安271017

摘要

Gyrovirus homsa 1（GyH1）是导致鸡传染性病毒性前胃炎（TVP）的已知病原体。本研究开发了一种基于胶体金免疫层析法（GICA）的检测方法用于GyH1的检测。我们制备了针对重组VP1蛋白的多克隆和单克隆抗体。使用柠檬酸三钠还原法合成了胶体金纳米颗粒，获得了粒径均匀的颗粒。单克隆抗体被结合到胶体金颗粒上，而多克隆抗体则作为捕获试剂固定在膜上。最佳标记条件为pH 8.8，单克隆抗体浓度为7.2 μg/mL。该检测方法能够特异性识别GyH1，检测限为10^3拷贝/μL。所有试纸条之间的重复性均得到验证。总之，GyH1 GICA方法具有高特异性、高灵敏度和良好的重复性，为监测GyH1的早期感染状态提供了有效且低成本的工具。

引言

Gyrovirus属（GyVs）包含小型、无包膜、单链环状DNA病毒，其基因组为负链结构（Fehér等人，2022年）。Gyrovirus homsa1（GyH1）是该属中的第三个被确认的物种，于2012年首次在患有胃肠炎的儿童粪便样本中被发现（Li等人，2021年）。Phan等人完成了GyH1基因组的测序，其长度为2359个碱基对（Chu等人，2012年；Phan等人，2012年）。该基因组包含三个重叠的开放阅读框（ORFs），编码三种蛋白质：衣壳蛋白VP1（1392 bp，463个氨基酸）、支架蛋白VP2（720 bp，239个氨基酸）和凋亡蛋白VP3（720 bp，125个氨基酸）。其中，VP1具有较高的免疫原性和稳定性（Zhang等人，2022年）。

2018年，在中国潍坊的一个养鸡场中检测到了患有前胃炎的肉鸡感染GyH1的病例。通过反向PCR扩增得到了GyH1的完整基因组序列，其长度为2356 bp（Li等人，2018年）。先前的研究表明（Yuan等人，2021年），GyH1可引起鸡的炎症、免疫抑制、生长发育迟缓以及多系统损伤（?mia?ek等人，2017年）。这些症状会显著影响肉鸡的生长性能，并给家禽产业带来重大经济损失（Yan等人，2022年）。

定量实时PCR（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）是常用的GyH1检测方法（Xiao等人，2021年）。尽管这些方法具有高特异性和灵敏度，但需要专业人员和复杂的仪器设备，操作耗时，不适合现场应用。为了解决疫情爆发时的快速现场诊断需求（Wang等人，2010年），本研究基于抗原-抗体结合原理开发了一种胶体金免疫层析法（GICA）（Tao等人，2016年；Yu等人，2018年）。这种快速检测方法能有效监测GyH1感染情况，并为疫情控制和预防提供技术支持（Liu等人，2021年；Wang等人，2021年）。

样本

我们在实验室中分离并保存了鸡贫血病毒（CAV）、鸭圆环病毒（DuCV）、猪圆环病毒（PCV）、禽白血病病毒J亚型（ALV-J）和鸡星状病毒（CAstV）的血清阳性样本，以及GyH1阳性的泄殖腔拭子样本和阴性对照样本。从一组被实验室分离的GyH1株感染的SPF鸡中收集了30份GyH1阳性的泄殖腔拭子；另外还从自然感染的鸡群中获取了50份拭子。

VP1蛋白的表达与纯化

SDS-PAGE分析显示，在约57 kDa处有一个与VP1对应的条带（图1A），这与其预期的分子量一致。使用BCA蛋白测定试剂盒测定了纯化VP1蛋白的浓度，并绘制了标准曲线（Y=1866.8X-154.43，R^2=0.998），显示出良好的线性关系。将VP1蛋白样本的吸光度值代入该公式计算得到其浓度为0.56 mg/mL。

讨论

免疫层析胶体金检测技术（GICA）基于特定的抗原-抗体反应原理（Siu等人，2016年）。其核心是将特异性抗体固定在硝酸纤维素膜上的预定测试区域。当样品被加入后，毛细作用使其在膜上移动。与检测抗体结合的胶体金颗粒会特异性地与目标抗原结合，形成可见的红色条带。

结论

总之，本研究开发的胶体金免疫层析试纸条具有高特异性和灵敏度。这种可在现场使用的检测方法允许非专业人员进行快速诊断，填补了GyH1感染诊断方面的空白。该方法可快速提供结果（几分钟内），为临床监测和控制工作提供及时的技术支持（Sun等人，2018年）。

伦理批准

所有动物实验程序均获得了山东农业大学动物伦理委员会的批准（批准编号：SDAU-2023-53），符合中国动物福利法规（GB/T 35892-2018）。

数据获取

本研究生成和分析的数据可应要求向相应作者索取。

未引用的参考文献

(Le?o等人，2021)

资助

本研究得到了山东省科技发展项目的资助（项目编号：2023CXGC010704）。

作者声明

• (1)
  所有作者确认本手稿为原创作品，未曾以任何形式（包括在线平台或会议论文集）发表，也未被其他期刊接受审稿。内容未抄袭任何其他文献，所有引用的参考文献均已准确无误地标注。
• (2)
  所有作者声明不存在潜在的利益冲突，包括与个人或组织的财务、个人或职业关系。

作者贡献声明

杨琦：撰写初稿、方法设计、数据分析、概念构建。程子强：撰写与编辑、方法设计、数据管理。严天星：方法设计、数据分析。王桂花：撰写与编辑、资源获取、项目协调、资金申请、数据管理、概念构建。

作者声明不存在利益冲突。

利益冲突声明

我们确认本手稿的提交过程中不存在利益冲突，所有作者均同意发表该手稿，且该研究为原创未发表的工作，未在其他地方（全部或部分）进行过评审。所有列出的作者均已批准该手稿的发表。