综述：硒蛋白对红细胞生成的氧化还原调控

《Biological Trace Element Research》：Redox Modulation of Erythropoiesis by Selenoproteins

　　本综述系统阐述了必需微量元素硒及其硒蛋白在应激性红细胞生成中的核心作用，重点揭示了其通过调控红细胞前体细胞内在信号和促消退型巨噬细胞极化，维持红细胞生成岛（EBI）微环境氧化还原平衡，从而对抗炎症性贫血的新机制，为相关贫血疾病的治疗提供了新视角（Erythropoiesis, SELENOP, GPX4）。

　　

氧化损伤对红细胞前体细胞及红细胞生成的影响

成熟红细胞（RBCs）及其前体——红细胞前体细胞，持续暴露于内源性的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）环境中。ROS是血红蛋白自动氧化过程的副产物和后续产物。血红蛋白自动氧化是一个自发过程，其中氧合血红蛋白（HbO₂）转化为高铁血红蛋白（MetHb）和超氧阴离子（O₂^•-），同时二价铁（Fe²⁺）被氧化为三价铁（Fe³⁺）。RNS，如一氧化氮（NO•）和过氧亚硝酸盐（ONOO^-），也加剧了红细胞内的氧化应激。在炎症、溶血性疾病或硒缺乏情况下，ROS/RNS的失衡导致过度的氧化应激，损害红细胞前体细胞的发育，最终导致贫血和氧输送受损。过量的ROS可引发脂质过氧化和膜损伤，导致细胞过早死亡。血红蛋白的氧化也促进由变性血红蛋白组成的亨氏小体形成，标记红细胞前体细胞以便被清除，从而限制红细胞产出。在硒缺乏条件下，加速的氧化应激增强了血红蛋白变性和聚集，导致红细胞内亨氏小体增多。

红细胞前体细胞和成熟红细胞严重依赖抗氧化防御系统来对抗ROS/RNS诱导的损伤，包括超氧化物歧化酶（SOD1和SOD2）、过氧化氢酶、硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）、非硒依赖的具有过氧化物酶活性的谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）以及硫氧还蛋白还原酶（TXNRDs）。此外，ROS诱导的DNA损伤会激活p53依赖性检查点，引起细胞周期停滞或凋亡，进一步减少祖细胞的扩增。铁代谢失调通过芬顿反应和铁死亡途径放大氧化损伤并破坏血红蛋白合成。这些机制对于防止膜氧化损伤、血红蛋白氧化和红细胞前体细胞发育受损至关重要。

应激性红细胞生成与炎症

稳态红细胞生成在健康个体的骨髓中每天产生超过10¹¹个红细胞，以替代被脾脏和肝脏清除的衰老红细胞。当感染或组织损伤引起炎症时，促炎细胞因子会抑制稳态红细胞生成。为了补偿这种产出的下降，应激性红细胞生成被启动。在小鼠中，短期造血干细胞（ST-HSCs）与单核细胞一起迁移到脾脏，分别发育成应激红系祖细胞（SEPs）和脾脏应激红细胞生成微环境。应激红细胞生成的第一步是扩增一群仅限于红系谱系且具有自我更新能力的瞬时扩增细胞。这种扩增由骨形态发生蛋白4（BMP4）、印度刺猬因子（IHH）和经典Wnt信号等发育信号驱动，它们与抑制稳态红细胞生成的促炎细胞因子协同作用。随后，SEPs在促消退信号如促红细胞生成素（Epo）、前列腺素J2（PGJ2）和前列腺素E2（PGE2）的驱动下，转变为红系定向祖细胞，失去自我更新能力，成为应激红系爆式集落形成单位（BFU-E）。应激BFU-E和红系集落形成单位（CFU-E）的终末分化与稳态红细胞生成相似。

在应激性红细胞生成过程中，鉴于对血红素、铁和细胞因子的巨大需求，红细胞前体细胞的发育发生在称为红细胞生成岛（EBI）的特殊结构中。在这些EBI内，中央巨噬细胞扮演着至关重要的“哺育”角色，支持周围红细胞前体细胞的增殖和分化为成熟红细胞。系统性炎症是触发应激性红细胞生成的关键信号。炎症性贫血（AI）或慢性病性贫血（ACD）是仅次于缺铁性贫血（IDA）的第二常见贫血。促炎信号，包括白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、干扰素γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子-α（TNFα），使造血干细胞（HSC）命运偏向髓系效应细胞以对抗感染，从而抑制稳态红细胞生成。IL-6和IL-1β刺激铁调节激素铁调素的表达，导致铁输出蛋白Ferroportin降解和铁在巨噬细胞中滞留，从而增加不稳定Fe²⁺和脂质过氧化。这种促铁死亡压力受到硒酶GPX4等硒蛋白依赖性抗氧化防御的对抗。

尽管炎症对稳态红细胞生成有负面影响，但促炎信号刺激脾脏中的红细胞吞噬作用，释放的血红素信号增强Ets家族转录因子Spi-C的表达。Spi-C介导微环境中单核细胞向巨噬细胞的发育，并驱动应激和/或炎症细胞释放的转化生长因子β（TGFβ）家族蛋白激素——生长分化因子15（GDF15）的表达，同时增加微环境中的BMP4。虽然促炎信号通过增加铁调素表达来限制铁可用性，但肾脏Epo产量增加驱动的SEPs扩增诱导了铁调素拮抗剂——红细胞铁调素（Erfe）的表达，促进铁释放以持续应激红系前体细胞的成熟。

最近一项研究揭示，应激性红细胞生成过程中SEPs向分化的定向转变受到Epo/Stat5依赖性信号的巧妙调控，该信号涉及巨噬细胞来源的PGJ2的产生。PGJ2是一种花生四烯酸衍生的环戊烯酮前列腺素代谢物，作为抗炎生物活性脂质介质和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的内源性配体。促进SEP增殖的Wnt信号被Epo/Stat5信号抑制，从而使SEP从增殖转向分化。升高的PGJ2激活PPARγ，从而抑制巨噬细胞中Wnt的表达。有趣的是，Epo/Stat5信号也促进PGE2的产生，表明来自花生四烯酸的多种前列腺素可能并行作用，在炎症条件下协同调节应激性红细胞生成。PGJ2及其衍生物15-脱氧-Δ^12,14-前列腺素J2（15d-PGJ2）以其通过结合PPARγ、NF-κB、Nrf2、AP-1等蛋白质而发挥抗炎作用而闻名。我们实验室的最新研究进一步证明，顺乌头酸的促消退代谢产物衣康酸通过激活Nrf2活性促进SEP分化。值得注意的是，促炎和促消退信号之间的严格平衡不仅对应激性红细胞生成至关重要，对稳态红细胞生成也至关重要。EBI巨噬细胞从促消退（替代激活）向促炎（经典激活）表型的极化已被证明会损害红细胞生成。

硒蛋白最近被认识为其作为抗氧化“守门员”的作用，可减弱促炎程序，包括环氧化酶-2（COX-2）、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β和IL-12，并启动促消退程序以促进炎症消退。值得注意的是，在炎症期间，巨噬细胞中的硒补充据报道可使花生四烯酸代谢偏向增加PGJ2和减少PGE2的产生，突出了其对类二十烷酸平衡的调节作用，同时也表明硒蛋白有潜力通过氧化还原依赖性机制作为炎症诱导的红细胞生成功能障碍的调节剂。

硒蛋白在红细胞生成微环境中的作用

硒蛋白已被确定为调节造血干细胞命运的关键调节因子。小鼠条件性HSC特异性硒蛋白缺失损害了HSC自我更新，破坏了B细胞成熟，并使HSC偏向髓系谱系。作为响应，代偿性的Nrf2信号机制被激活。此外，铁死亡抑制剂维生素E可以部分缓解B细胞成熟障碍，强调了GPX4在HSC命运调控中的重要性。这些小鼠还出现大细胞性贫血，表现为血红蛋白水平降低、平均红细胞体积（MCV）升高、外周血中红细胞前体细胞降解以及因诱导应激性红细胞生成而导致的脾肿大。这些发现进一步证实了先前的研究，即小鼠硒缺乏会严重影响应激性红细胞生成，从而加剧贫血。

我们实验室之前的一项研究表明，与硒充足饮食的小鼠相比，硒缺乏饮食的小鼠表现出单核细胞募集延迟和向红髓巨噬细胞成熟受损。这种延迟损害了EBI的形成，进一步损害了应激性红细胞生成。一致地，在巨噬细胞中缺失硒蛋白的小鼠由于Spi-C介导的单核细胞募集和红髓巨噬细胞成熟缺陷而表现出从溶血性贫血中恢复延迟。有趣的是，将硒充足补充的单核细胞移植到硒缺乏小鼠中部分挽救了这种缺陷，突出了巨噬细胞和红细胞前体细胞来源的硒蛋白在调节应激性红细胞生成中的协同作用。

作为众所周知的抗氧化剂，硒蛋白可减弱巨噬细胞中的促炎信号。硒处理骨髓来源的巨噬细胞可降低COX-2和TNFα表达，表明其抗炎作用。COX-2是一种由炎症刺激诱导的酶，催化花生四烯酸转化为生物活性脂质介质，包括PGE2、PGD2和PGJ2，影响促炎和抗炎信号之间的平衡。在LPS通过NF-κB介导的刺激下，硒蛋白通过PPARγ依赖性正反馈环上调巨噬细胞中造血前列腺素D2合酶的表达，增强抗炎性环戊烯酮前列腺素（如PGJ2和15d-PGJ2）的产生。升高的PGJ2和15d-PGJ2随后抑制NF-κB信号，通过抑制微粒体前列腺素E合酶-1和血栓烷合酶减少PGE2的产生。这些研究共同表明，硒蛋白补充可以将巨噬细胞极化从经典激活的促炎状态转向替代激活的促消退表型。连同Epo/Stat5驱动的PGJ2产生，这些发现表明硒蛋白通过调节EBI巨噬细胞中的巨噬细胞极化来调节应激性红细胞生成。

硒蛋白在红系细胞及红细胞生成中的作用

谷胱甘肽过氧化物酶

这是研究最深入的硒蛋白家族，通过还原H₂O₂和脂质氢过氧化物来保护红细胞免受氧化应激。GPX1是红细胞中最丰富的GPX亚型，并且在红细胞生成过程中高表达。它是第一个被纯化的硒蛋白，最初从红细胞中分离出来。GPXs有效地将H₂O₂降解为H₂O，同时将谷胱甘肽氧化为氧化型谷胱甘肽。然后，氧化型谷胱甘肽在依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的谷胱甘肽还原酶作用下被还原。作为红细胞前体细胞中对抗氧化应激的关键抗氧化防御，GPX1尤其在异常应激条件下保护红细胞免受高水平内源性和外源性过氧化物的侵害。然而，Gpx1基因敲除小鼠并未显示红细胞在过氧化物保护方面存在缺陷，表明红细胞前体细胞中存在补偿机制，包括硫氧还蛋白依赖性过氧化物氧还蛋白等酶。PRX2作为对抗内源性H₂O₂和其他过氧化物的屏障，并且已知与GPX1协同耦合。然而，PRX2的氧化状态是其活性的关键决定因素，从而突出了硒蛋白在红细胞前体细胞氧化还原保护中的互补作用，有助于限制PRX2过度氧化并保持其活性。

GPX4已被确定为在造血和红细胞生成中至关重要的关键GPX亚型。GPX4在大多数细胞类型和组织中表达，尽管水平低于红细胞中的GPX1。GPX4是一种磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶，以谷胱甘肽为辅因子，催化磷脂氢过氧化物还原为无毒的磷脂醇。GPX1、GPX2和GPX3主要还原可溶性氢过氧化物，而GPX4独特地适应还原生物膜内的磷脂氢过氧化物。GPX4是铁死亡的关键调节因子，铁死亡是一种高度调节的细胞死亡形式，以铁依赖性脂质过氧化为特征，独立于凋亡和坏死性凋亡等其他细胞死亡形式。异常的红细胞生成，如β-地中海贫血，其特征是红细胞前体细胞具有较高的ROS，在红系成熟的后期阶段最为明显。铁过载导致Fe³⁺通过转铁蛋白受体大量流入，通过六次跨膜前列腺上皮抗原3积累Fe²⁺，这既可以促进血红素生物合成，也可以通过芬顿反应加剧ROS产生。丰富的血红素铁加速ROS产生，导致细胞氧化稳态失衡。热休克蛋白b-1通过限制转铁蛋白受体的可用性来调节铁摄取，而Nrf2调节参与血红素降解的途径，从而构成两个关键的相互交织的铁死亡调节机制。主要在造血和免疫细胞中缺失硒蛋白的小鼠模型中，红细胞前体细胞中出现了Nrf2依赖性的ROS清除代偿，突出了Nrf2与硒蛋白（尤其是GPX4）之间的协调作用。

与GPX4并行，维生素E通过清除脂质自由基来调节脂质过氧化。因此，维生素E缺乏进一步加剧氧化损伤，导致更高的HSC死亡。有趣的是，小鼠红系前体细胞中GPX4缺失诱导了受体相互作用蛋白激酶3依赖的坏死性凋亡，而非铁死亡，这可以通过维生素E补充来挽救。GPX4被认为通过非铁死亡过程在网织红细胞脱核中起关键作用。虽然脂质过氧化物引发铁死亡，但这些脂质过氧化物也能形成反应性醛中间体，如丙二醛和4-羟基-2-壬烯醛，它们可以消耗细胞谷胱甘肽并共价修饰蛋白质硫醇，从而加剧氧化还原应激。HSC中GPX4缺失会损害网织红细胞脱核，原因是脂质过氧化物积累增加，抑制了线粒体裂解。RSL3诱导的GPX4不可逆抑制导致脂筏聚集，减少网织红细胞中肌球蛋白轻链的磷酸化，这一过程独立于铁死亡、坏死性凋亡、凋亡和线粒体自噬，损害了网织红细胞脱核。这些发现共同突出了GPX4在造血、红细胞生成和网织红细胞成熟中的多功能调节作用，其作用超出了铁死亡，涉及维持脂质稳态和细胞完整性。

硒蛋白P、硒蛋白W、硒蛋白N及其他硒蛋白

除了GPXs，其他硒蛋白作为抗氧化剂的功能也可能促进红细胞生成，包括在贫血和/或炎症条件下的应激性红细胞生成。然而，对这些蛋白的了解要少得多。

硒蛋白P是一种血浆蛋白，含有多个硒半胱氨酸残基，主要从肝脏分泌，尽管在特定细胞类型中的肝外表达也是已知的。SELENOP主要作为硒的转运体，影响不同器官和组织，其中硒半胱氨酸被用于掺入其他硒蛋白，用于氧化还原调节和其他细胞功能。研究表明，急性心力衰竭患者中低SELENOP与较低的血红蛋白和增加的转铁蛋白受体相关，这会损害红细胞生成并促进贫血。在重型地中海贫血中，终身输血导致铁过载和甲状腺功能障碍，循环SELENOP相应较高，并与促甲状腺激素呈负相关。虽然SELENOP在红细胞前体细胞发育中的确切作用尚不清楚，但鉴于其作为全身硒转运体的作用，以及SELENOP的表达与总硒水平密切相关的事实，红细胞前体细胞发育中其他硒蛋白的表达很可能对SELENOP的水平做出响应。

另一个调节应激性红细胞生成的关键硒蛋白是硒蛋白W。SELENOW是一种9-kDa的谷胱甘肽依赖性硒蛋白，含有硫氧还蛋白样折叠和一个保守的CxxU（C：半胱氨酸；U：硒半胱氨酸）基序，作为二硫键还原酶发挥作用。SELENOW的表达对膳食硒高度敏感。与硒缺乏饮食相比，在硒充足饮食的小鼠中，SELENOW是在早幼红细胞和嗜碱性红细胞中最显著上调的蛋白质之一，突出了其在应激性红细胞生成过程中红细胞前体细胞成熟中的潜在作用。SELENOW的缺失抑制了应激BFU-E细胞集落的体外生长，并诱导小鼠红系细胞系G1E的终末成熟缺陷。在GATA1缺失的G1E细胞系ER4中，SELENOW缺失显著减少了G2/M期细胞。SELENOW通过从CDC25B解离14-3-3蛋白来促进DNA损伤后的G2/M期转换。上皮细胞中SELENOW的缺失也诱导G1期停滞，表明SELENOW在红细胞前体细胞成熟过程中可能具有调节细胞周期的作用。

除了上述硒蛋白，其他可能调节红细胞前体细胞发育的硒蛋白的身份仍有待鉴定。根据先前的一项研究，硒蛋白N是另一个可能在应激性红细胞生成中起作用的候选硒蛋白。完全缺失内质网驻留蛋白SELENON导致从苯肼诱导的急性溶血性贫血中恢复的损害显著大于杂合子小鼠，表现为更低的血细胞比容。根据其在通过调节肌浆网钙转运ATP酶活性维持肌肉卫星细胞内钙稳态的功能，SELENON可能在SEP分化过程中充当潜在的调节因子，这些SEP显示出与肌肉卫星细胞相似的特征。另一个可能调节红细胞生成的值得注意的蛋白是硒结合蛋白1。它被表征为一种保守的铜依赖性硫醇氧化酶，能结合硒但不含硒半胱氨酸残基。SBP1蛋白在用人骨髓分化的CD34+祖细胞经Epo刺激后表达上调。鉴于其在结合硒和氧化还原依赖性调节细胞增殖中的作用，SBP1与硒蛋白合成中硒可用性的相互作用可能是红细胞前体细胞发育中的一个重要途径，突出了硒、铜和铁之间的相互作用。

综上所述，在小鼠模型中，硒缺乏导致轻度贫血，并在溶血应激后恶化，突出了硒蛋白通过氧化还原依赖性机制调节红细胞生成的关键作用。硒蛋白组的缺失使HSC命运偏向髓系谱系，B细胞产出减少，脾脏红细胞生成增加，表明了硒蛋白对HSC微环境的深远影响。在巨噬细胞中，硒蛋白减弱促炎信号，并通过诱导COX-2介导的PGJ2产生促进促消退环境。在Epo刺激下，升高的PGJ2抑制Wnt信号，促进SEP从增殖向分化转变。硒和硒蛋白是否通过这一途径成为EBI内应激红系祖细胞发育的潜在关键调节因子尚不清楚，目前正在研究中。此外，膳食硒对稳态红细胞生成的影响也需要进一步研究。尽管硒蛋白在红细胞前体细胞中广泛表达，但只有少数硒酶（如GPX1和GPX4）在铁死亡以及H₂O₂和脂质氢过氧化物解毒中的作用得到了详细研究。硒缺乏小鼠应激性红细胞生成受损表明硒敏感硒蛋白（包括SELENOW、SELENOP和SELENOH）在应激下氧化还原调节中的潜在功能。此外，由于内质网应激在红系分化和炎症诱导的贫血中至关重要，内质网驻留硒蛋白如SELENON、SELENOO和SELENOS也可能通过钙稳态和蛋白质稳态发挥作用。未来解析个体硒蛋白功能的研究可能为贫血和炎症相关造血疾病揭示新的治疗靶点。